中性粒细胞型哮喘患儿急性发作期CXCL8、CXCL9与气道炎症的关系研究

目的探讨中性粒细胞型哮喘(NA)患儿急性发作期CXC趋化因子配体(CXCL)8、CXCL9与气道炎症的关系。方法选取2020年11月至2021年11月就诊于该院的235例NA患儿作为研究对象,其中处于急性发作期的患儿138例(急性组),处于临床缓解期的患儿97例(缓解组)。采用肺功能仪测定两组用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV_(1)),计算FEV_(1)占预计值的百分比(FEV_(1)%prep)和FEV_(1)/FVC;采用流式细胞分析仪观察中性粒细胞活化率,比色法测定上清液去甲肾上腺素(NE)活性,硝酸还原比色法测定上清液一氧化氮(NO)水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清白细胞介素(IL)-8、IL-17、IL-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和CXCL9水平,固相夹心ELISA检测血清CXCL8水平。采用Pearson相关性分析炎症因子、趋化因子与肺功能的关系,以及趋化因子与气道炎症的关系。结果急性组患儿FVC、FEV_(1)、FEV_(1)/FVC和FEV_(1)%prep均明显低于缓解组,差异有统计学意义(P<0.05);急性组患儿中性粒细胞活化率、NE活性和NO水平均明显高于缓解组,差异有统计学意义(P<0.05);急性组患儿IL-8、IL-17、IL-10、TNF-α、CXCL8、CXCL9水平均明显高于缓解组(P<0.05);Pearson相关性显示,趋化因子、炎症因子水平均与患儿肺功能呈负相关,趋化因子与气道炎症呈正相关。结论NA患儿急性发作期CXCL8、CXCL9水平与气道炎症及肺功能有关。

中性粒细胞型哮喘患者的气道炎症与小气道重构分析

目的:研究支气管哮喘(哮喘)患者的气道炎症表型分布,分析中性粒细胞哮喘表型的炎症标志物和临床特征,以及肺小血管和小气道重构指标。方法:采用横断面研究方法,选择北京大学第三医院呼吸内科2015年1月至12月完成诱导痰细胞学检查的患者63例,收集一般资料,记录哮喘控制测试(ACT)结果和肺功能,分析患者的诱导痰细胞计数及分类、诱导痰活化基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)水平,血清瘦素、Ig E、骨膜素及TGF-β1水平,分析肺CT肺小血管横截面积及小气道横截面积。结果:哮喘患者的气道炎症表型分布为嗜酸粒细胞型22例(34.9%),中性粒细胞型22例(34.9%),混合细胞型15例(23.8%),寡细胞型4例(6.3%)。中性粒细胞型哮喘与嗜酸性粒细胞型相比,痰活化MMP-9水平显著增高[179.1(74.3,395.5)vs.50.5(9.7,225.8),P<0.05]。痰中性粒细胞计数与第一秒用力呼气量占预测值百分比(predicted percentage of forced expiratory volume in the 1st second,FEV1%pred)呈显著负相关(r=-0.304,P<0.05),与痰活化MMP-9水平成显著正相关(r=0.469,P<0.05),与小气道校正壁厚呈相关趋势(r=0.533,P=0.06)。痰活化MMP-9水平与FEV1%pred呈负相关(r=-0.281,P<0.05),与小气道校正壁厚呈相关趋势(r=0.612,P=0.06),与校正管径面积呈正相关(r=0.636,P<0.05)。外周血中性粒细胞计数与痰中性粒细胞计数呈正相关(r=0.355,P<0.05),与痰MMP-9水平呈正相关(r=0.330,P<0.05)。结论:哮喘患者气道中性粒细胞数量与肺功能相关,中性粒细胞可能通过释放MMP-9加重小气道重构;痰中性粒细胞计数与外周血中性粒细胞计数相关,有可能作为判断炎症亚型的替代物。

泻肺定喘汤对中性粒细胞型哮喘大鼠KLF-2/RelA比例平衡及中性粒细胞凋亡的影响

目的观察泻肺定喘汤对中性粒细胞型哮喘大鼠KLF-2/RelA比例平衡及中性粒细胞凋亡的影响。方法 48只大鼠随机分为空白组、模型组、地塞米松组和泻肺定喘汤低、中、高剂量组。除空白组外,其余组均按照脂多糖(LPS)+卵白蛋白(OVA)联合致敏的方法复制中性粒细胞型哮喘模型。造模后各药物干预组给予相应的药物治疗,空白组和模型组给予等体积的0.9%氯化钠注射液灌胃治疗,每日1次,连续2周。疗程结束后观察各组大鼠肺泡灌洗液中白细胞计数及分类,流式细胞术检测外周血中性粒细胞的凋亡,并通过Western blotting法测定中性粒细胞中KLF-2、RelA、Bax和Bcl-2蛋白的表达。结果与模型组比较,泻肺定喘汤中、高剂量均能够显著降低肺泡灌洗液中白细胞数量及中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的百分比,增加中性粒细胞的凋亡,差异均具有显著统计学意义(P <0.01);此外,泻肺定喘汤中、高剂量还能显著降低中性粒细胞中Bcl-2蛋白的表达,上调KLF-2、RelA、Bax蛋白的表达和KLF-2/RelA、Bax/Bcl-2的比值,与模型组比较,差异均具有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。结论泻肺定喘汤能够通过调控KLF2/RelA比例的平衡,从而促进中性粒细胞的凋亡,减轻炎症反应。

中性粒细胞型哮喘差异表达基因的生物信息学分析及其潜在治疗药物筛选

目的运用生物信息学方法与分子对接技术筛选中性粒细胞型哮喘(neutrophilic asthma,NA)的差异表达基因(DEGs)及其潜在治疗药物,为其治疗提供新的靶点和药物。方法从GEO数据库筛选NA与健康人群的DEGs,通过STRING数据库构建DEGs的蛋白互作(PPI)网络筛选关键基因,并对DEGs进行GO功能注释与KEGG通路富集分析,采用分子对接技术筛选潜在的先导化合物。结果共筛选出147个DEGs;PPI网络分析筛选出CXCL8、FPR2、CXCL1、TNFRSF1B、CXCR1等10个关键基因;GO分析表明DEGs参与炎症与免疫反应、趋化作用等生物过程;KEGG通路分析显示DEGs主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、补体与凝血等信号通路;分子对接显示芍药苷元酮与雷公藤甲素与补体与凝血通路中C8B、PLAU等基因蛋白具有很好的结合活性。结论本研究发现补体与凝血信号通路或许可以成为NA新的治疗靶点,芍药苷元酮与雷公藤甲素是潜在的治疗药物。

中性粒细胞型哮喘患儿急性发作期血清颗粒蛋白前体与疾病严重程度及气道炎症的关系

目的:探讨中性粒细胞型哮喘患儿急性发作期的血清颗粒蛋白前体(PGRN)与疾病严重程度及气道炎症的关系。方法:选取2019年1月至10月期间在我院儿科就诊的185例哮喘患儿,包括115例急性发作期患儿(急性组)和70例临床缓解期患儿(缓解组),另外选取30例健康儿童的血样作为对照组,用以检测血清PGRN水平。将哮喘患儿根据痰涂片进行气道炎症分型;另外检测两组哮喘患儿血清PGRN、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)、全血中性粒细胞(NEU)计数、肺功能参数[用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1)、最大呼气峰值流速(PEF)、FEV1占预计值的百分比(FEV1%pred)和FEV1/FVC]。采用多因素Logistic回归分析法和受试者工作特征(ROC)曲线评估血清PGRN水平诊断重度哮喘的价值。结果:急性组和缓解组患儿血清PGRN水平低于对照组,尤其是急性组患儿血清PGRN水平降低更明显(P<0.001)。急性组中性粒细胞型患儿血清PGRN水平低于嗜酸粒细胞型患儿(P<0.05)。经Pearson相关性分析,中性粒细胞型哮喘急性发作期患儿血清PGRN水平与FEV1%pred、FEV1/FVC、PEF均呈正相关(r=0.756、0.703、0.411,P<0.001),并且与血清TNF-α水平、IL-8水平、全血NEU计数均呈负相关(r=-0.537,-0.541,-0.413,P<0.001)。经多因素Logistic回归分析,血清PGRN是中性粒细胞型哮喘急性发作期患儿重度疾病的独立保护因素(OR=0.886,95%CI:0.847~0.958,P<0.001),且血清PGRN水平诊断中性粒细胞型哮喘急性发作期患儿重度疾病的ROC曲线下面积为0.876(95%CI:0.781~0.972),灵敏度和特异度分别为73.90%和88.50%。结论:检测中性粒细胞型哮喘患儿急性发作期时的血清PGRN水平可以反映疾病严重程度,其有望成为新的抑制中性粒细胞气道炎症反应加重的潜在靶点。

诱导痰Galectin-3BP及相关炎症因子水平检测在中性粒细胞型哮喘诊断中的价值

目的探讨诱导痰半乳糖凝集素-3结合蛋白(Galectin-3BP)及相关炎症因子水平检测在中性粒细胞型哮喘诊断中的价值。方法选择2018年10月~2019年6月江汉大学附属医院呼吸与危重症医学科收治的65例哮喘患者为研究对象,其中中性粒细胞型哮喘组(NA)27例,嗜酸粒细胞型哮喘组(EA)38例,ELISA法检测两组患者诱导痰Galectin-3BP的表达水平,并分析Galectin-3BP与诱导痰炎症细胞及炎症因子的相关性。结果NA组诱导痰Galectin-3BP水平与EA组比较(102.86±24.08ng/ml vs 64.02±18.93ng/ml),差异有统计学意义(t=47.314,P<0.05)。直线相关分析显示诱导痰Galectin-3BP与IL-1β,IL-6和IL-8均呈正相关(r=0.670,0.632和0.651,均P<0.001),与诱导痰中性粒细胞、巨噬细胞及淋巴细胞数均呈正相关(r=0.475,0.461和0.454,均P<0.05),与嗜酸性粒细胞数无明显相关性(r=-0.219,P>0.05)。结论诱导痰Galectin-3BP在NA患者中高表达,且与中性粒细胞相关炎症因子呈正相关,可作为NA的生物标志物。

PGRN与中性粒细胞型哮喘患儿病情的相关性分析

目的探讨并分析血清颗粒蛋白前体(PGRN)与中性粒细胞型哮喘患儿病情的相关性。方法选取2019年5月至2021年5月在郑州大学附属儿童医院确诊的中性粒细胞型哮喘患儿94例,根据患儿病情的严重程度分为轻度组37例、中度组32例及重度组25例。采用酶联免疫吸附试验法(ELISA)检测并比较三组患儿的PGRN、肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素-8(IL-8)水平,采用德国康讯肺功能机检测三组用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼气容积(FEV1),计算FEV1/FVC;采用Pearson相关性分析PGRN水平与FEV1、FVC及FEV1/FVC的关系。结果中度组及重度组FEV1、FVC及FEV1/FVC水平低于轻度组(P<0.05);中度组及重度组PGRN、TNF-α及IL-8水平均高于轻度组(P<0.05);PGRN水平与FEV1(r=-0.241,P=0.015)、FVC(r=-0.252,P=0.012)及FEV1/FVC(r=-0.225,P=0.025)均呈负相关。结论PGRN与肺功能水平呈现负相关关系,通过检测PGRN水平可反映中性粒细胞型哮喘患儿病情的严重程度。

基于网络药理学及体内实验探讨射麻止喘液治疗中性粒细胞型哮喘的分子机制

目的基于网络药理学及体内实验探讨射麻止喘液治疗中性粒细胞型哮喘(NA)的分子机制。方法(1)利用中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)、文献检索及Swiss ADME、Swiss Target Prediction数据库检索、筛选射麻止喘液的活性成分及其作用靶点。利用OMIM、Gene Cards、Dis Ge NET及Drug Bank数据库检索、筛选NA疾病相关靶点。通过微生信平台对射麻止喘液活性成分作用靶点与NA疾病相关靶点取交集,得到射麻止喘液治疗NA的潜在作用靶点(共有靶点)。采用Cytoscape 3.8软件构建“中药-活性成分-潜在作用靶点”网络。通过STRING数据库建立潜在作用靶点蛋白互作(PPI)网络,使用内置Mcode插件分析获得核心靶点。使用Metascape平台对潜在作用靶点进行基因本体(GO)、京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。(2)将BALB/C小鼠适应性喂养1周后,随机分为空白组、NA模型组、射麻止喘液低剂量组(2.5 g·kg^(-1))、射麻止喘液高剂量组(10 g·kg^(-1))、地塞米松对照组(1 mg·kg^(-1));通过腹腔注射致敏剂[鸡卵清白蛋白(OVA)+弗氏完全佐剂(CFA)]并通过雾化吸入激发的方法复制NA小鼠模型,第0、7、14天分别腹腔注射OVA+CFA(20μg OVA+75μg CFA,0.3 m L)致敏,第21~30天采用5%OVA混悬液雾化激发(每次8 m L,每次雾化时间40 min,每天1次);雾化激发前1 h各组灌胃给药,地塞米松对照组腹腔注射给药,每天1次。采用HE染色法观察小鼠肺组织病理变化;ELISA法检测肺泡灌洗液中IL-8含量;RT-q PCR法检测肺组织中NLRP3、CXCR2 m RNA表达水平;免疫组化法检测肺组织中p-m TOR蛋白表达水平。结果(1)共筛选得到射麻止喘液活性成分作用靶点826个,NA疾病相关靶点154个,取交集后得到射麻止喘液治疗NA的51个潜在作用靶点(共有靶点)。通过“中药-活性成分-潜在作用靶点”网络分析得到槲皮素、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、柚皮素等关键活性成分。通过对潜在作用靶点的PPI网络分析得到29个核心靶点,包括AKT1、IL6、TNF、EGFR、NLRP3、RELA、MIF、CXCR2、VEGFA等。GO功能富集分析得到882个生物学过程条目、33个细胞组分条目、61个分子功能条目;KEGG通路富集分析得到142条信号通路,主要涉及TNF信号通路、甲型流感信号通路、Toll样受体通路、MAPK信号通路、m TOR信号通路等。(2)动物实验结果:与空白组比较,NA模型组小鼠的气道黏膜损伤明显,结构紊乱,有大量炎性细胞浸润,黏膜充血、水肿,肺泡壁明显增厚,肺泡腔缩小;肺泡灌洗液中的炎症因子IL-8水平明显升高(P<0.05);小鼠肺组织NLRP3、CXCR2 m RNA表达显著上调(P<0.01),p-m TOR蛋白表达水平明显升高。与NA模型组比较,射麻止喘液低、高剂量组小鼠肺组织支气管上皮细胞结构排列可见少许紊乱,气管及血管周围有少量的炎性细胞浸润,支气管黏膜充血水肿明显减轻;小鼠肺组织CXCR2 m RNA表达显著下调(P<0.01),p-m TOR蛋白表达水平明显降低。射麻止喘液高剂量组小鼠肺泡灌洗液中的IL-8水平明显降低(P<0.05);射麻止喘液低剂量组小鼠肺组织NLRP3m RNA表达明显下调(P<0.05)。结论射麻止喘液对NA的治疗作用可能是通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等关键活性成分,作用于NLRP3、CXCR2等核心靶点,调控TNF信号通路、MAPK信号通路、Toll样信号通路、m TOR等关键信号通路来实现的。

基于代谢组学研究中药定喘汤对中性粒细胞型哮喘小鼠的疗效及作用机制

目的基于代谢组学的方法, 从内源性代谢物的变化分析定喘汤对中性粒细胞型哮喘的干预效果及其可能机制。方法 40只C57BL/6小鼠随机分为5组, 分别为正常组(A组)、中性粒细胞型哮喘模型组(B组)、定喘汤低剂量治疗组(C组)、定喘汤中剂量治疗组(D组)、定喘汤高剂量治疗组(E组), 每组8只。B、C、D、E组采用卵清白蛋白(OVA)和完全弗氏佐剂(CFA)联合诱导致敏小鼠建立中性粒细胞型哮喘模型, C、D、E组采用不同生药浓度的定喘汤进行干预治疗。采用Buxco小动物肺功能检测仪评估小鼠的气道反应性;提取肺泡灌洗液(BALF)采用计数板计数其白细胞总数, 细胞涂片染色进行分类计数;HE染色观察肺组织的病理改变。采用高效液相色谱联用四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS/MS)检测各组小鼠的血清代谢物, 采用常用的主成分分析(PCA), 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)模型对血清中代谢物图谱进行统计分析, 从内源性代谢物的变化来反映定喘汤的干预效果及其可能机制。结果 (1)一般行为观察:除A组小鼠外, 其他各组小鼠在激发期间均出现不同程度的哮喘症状。定喘汤各治疗组(C、D、E组)小鼠症状较B组程度减轻。(2)气道反应性:B组小鼠对乙酰甲胆碱(MCh)的气道反应性随着吸入浓度的升高而增加, 各浓度MCh水平下的气道阻力均明显高于A组(均P<0.01);C、D、E组气道反应性低于B组(均P<0.01);D、E组小鼠气道反应性低于C组(均P<0.05);D、E组气道反应性比较差异无统计学意义(P>0.05)。(3)气道炎症细胞浸润:B组小鼠BALF中白细胞总数、中性粒细胞百分率明显高于A组(均P<0.01);C、D、E组白细胞总数、中性粒细胞百分率低于B组(均P<0.01);D、E组小鼠白细胞总数、中性粒细胞百分率低于C组(均P<0.01);D、E组之间比较差异无统计学意义(均P>0.05)。(4)肺组织病理改变:A组小鼠肺组织未见病理改变。B组可见支气管管腔变狭窄, 管腔内黏膜皱褶增生、上皮细胞脱落、肿胀及可见黏液栓、肺泡及肺组织结构破坏, 支气管及血管周围大量炎症细胞浸润等典型病理学改变, 其中以中性粒细胞及淋巴细胞浸润最明显;定喘汤各治疗组肺组织结构破坏、支气管黏膜水肿及炎症细胞浸润较B组均明显改善, 其中D组小鼠肺组织病理改变相对较轻。(5)代谢组学分析:各组小鼠血清代谢物经PCA、PLS-DA以及OPLS-DA分析显示, A组和B组小鼠血清代谢物存在明显差异。通过代谢通路分析发现, 不同生药浓度的定喘汤干预治疗可以在不同程度上改善哮喘疾病所致的代谢紊乱。结论定喘汤能有效减轻中性粒细胞型哮喘小鼠的气道炎症、气道高反应, 有效调节中性粒细胞型哮喘所致的代谢异常。