中性粒细胞胞外诱捕网形成与清除机制及其在肝脏损伤中的作用

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞除吞噬和脱颗粒作用之外,近年来发现的另一种捕获清除病原体,发挥抗感染作用的重要手段。研究发现,NETs除了与免疫防御有关,还参与血栓、癌症等的发生发展。本文就NETs的形成与清除机制,及其在酒精相关性肝病、非酒精性脂肪性肝病、肝移植以及肝癌等肝脏损伤中作用研究进行综述,以期为寻找肝损伤预防与治疗的新靶点提供参考。

桃红四物汤加减方通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成对大鼠骨折后深静脉血栓形成的影响

目的 探究桃红四物汤加减方通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成对大鼠骨折后深静脉血栓形成的实验研究。方法 将24只大鼠随机分为空白对照组、模型对照组、阳性药物组、中药组,每组6只。制备机械损伤性大鼠股骨骨折模型,对照组和模型对照组给于生理盐水灌胃,阳性药物组给予利伐沙班片,中药组按照方剂1 mL·100 kg^(-1)大鼠体质量灌胃。造模后7 d眼球取血,检测各组抗凝指标水平;ELISA法检测各组血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、瓜氨酸化组蛋白H3(Cit-H3)、髓过氧化物酶(MPO)和D-二聚体(DD)水平;检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活力水平和丙二醛(MDA)水平;观察左股静脉组织标本HE染色形态。结果 与空白对照组比较,模型对照组血清APTT、PT和TT水平均降低,DD水平升高(P<0.01);与模型对照组比较,阳性药物组与中药组的血清APTT、PT和TT水平均升高,DD水平降低(P<0.05或0.01);与空白对照组比较,模型对照组血清中SOD活力水平降低,MDA含量升高(P<0.01);与模型对照组比较,阳性药物组与中药组血清中SOD活力水平升高,MDA含量降低(P<0.05或0.01);与空白对照组比较,模型对照组血清中IL-6和TNF-α含量升高(P<0.01);与模型对照组比较,阳性药物组与中药组IL-6和TNF-α含量降低,且中药组低于阳性药组(P<0.05或0.01);与空白对照组比较,模型对照组血清中MPO水平升高,Cit-H3水平降低(P<0.01);与模型对照组比较,阳性药物组与中药组的血清MPO、Cit-H3水平均降低,且中药组低于阳性药物组(P<0.01);空白对照组静脉形态结构正常,无炎症细胞浸润;DVT组可见血栓形成,静脉内膜且有损伤,血管内皮细胞出现剥脱现象,血管壁炎性细胞浸润;阳性药物组仍可见血栓,但小于模型对照组;中药组血栓小于模型对照组。结论 桃红四物汤加减方对大鼠深静脉血栓的形成具有防治作用,其机制可能是通过抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成抑制炎症发生,从而干预血栓的形成。

南蛇藤总萜抑制中性粒细胞胞外诱捕网形成的作用与机制研究

为探索南蛇藤总萜(the total terpenoids of Celastrus orbiculatus Thunb.,TTC)对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成及其作用机制,通过分离与制备中性粒细胞,建立佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导的NETs形成细胞模型。利用瑞氏-姬姆萨染色、扫描电镜与免疫荧光技术研究南蛇藤总萜对NETs形成及其生物学标志的影响,并利用Annexin V/PI试验研究南蛇藤总萜对中性粒细胞凋亡的影响。结果表明:南蛇藤总萜能剂量依赖性地抑制PMA诱导的NETs形成;南蛇藤总萜(80μg·mL^(-1))可阻断中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)的释放,并破坏NETs相关DNA-NE复合物的形成;南蛇藤总萜(80μg·mL^(-1))可显著抑制PMA诱导的瓜氨酸化组蛋白H3(citrullinated histone H3,CitH3)的表达水平;南蛇藤总萜可剂量依赖性地促进中性粒细胞凋亡。综上,南蛇藤总萜对中性粒细胞NETs的形成具有抑制作用,其机制可能与其直接诱导中性粒细胞凋亡有关。

GSK484抑制强直性脊柱炎中中性粒细胞胞外诱捕网形成和炎症反应

目的探究GSK484对强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成和炎症反应的作用及其相关机制。方法检测AS患者和健康受试者外周血PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平和NETs形成差异。将30只Balb/c小鼠分为:对照组、模型组、GSK484给药组。模型组、GSK484给药组进行AS造模,GSK484给药组造模后连续一周灌胃4 mg/kg GSK484,其余组灌胃同体积生理盐水。结束后比较各组小鼠踝关节损伤评分,NETs水平和PAD4、H3cit、IL-6、IFN-γ水平。结果与健康受试者比较,AS患者外周血PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平升高,NETs形成和IL-1β、IL-6水平升高。与模型组比较,GSK484给药组小鼠踝关节损伤评分、NETs形成和PAD4、H3cit、IL-1β、IL-6水平降低。结论GSK484可抑制NETs形成,为缓解AS炎症反应提供了新的治疗策略。

对银屑病患者外周血中性粒细胞胞外诱捕网形成的观察

目的:探索中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)在银屑病患者病情评估中的临床应用价值。方法:收集63例银屑病患者及27例健康体检者外周血各2 ml,密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞,免疫荧光染色观察NETs形成情况,计算NETs数量及荧光强度,并与临床分型、疾病严重程度及炎症指标进行相关性分析。收集其中5例银屑病患者皮损组织,免疫荧光法观察NETs。结果:银屑病患者外周血自发NETs的比例及荧光强度显著高于健康对照者,且与银屑病PASI评分呈正相关。合并代谢异常或TNF-α异常的银屑病患者中NETs生成高于不合并代谢异常或TNF-α正常的银屑病患者。银屑病皮损中的NETs表达增多。结论:NETs水平与银屑病、银屑病合并代谢异常患者的疾病严重程度相关,或可反映银屑病及银屑病代谢共病的炎症状态用于疾病评估。

羟氯喹抑制MEK/ERK/ROS通路减少中性粒细胞胞外诱捕网形成改善葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠结肠炎

目的:探讨羟氯喹(hydroxychloroquine,HCQ)对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt,DSS)诱导的结肠炎模型鼠肠道炎症的影响及其影响中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap,NET)形成的机制。方法:雄性C57BL/6鼠随机分为正常组、DSS组(自由饮用3%DSS溶液+200μL纯水每天灌胃)、DSS+HCQ组[自由饮用3%DSS溶液+200μL HCQ(60 mg/kg)每天灌胃]。评估小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI),造模7 d后处死小鼠,分析小鼠结肠长度,肠组织HE染色评估肠道炎症水平,荧光显微镜及荧光酶标仪检测各组小鼠结肠组织NET水平。收集志愿者外周血提取中性粒细胞进行细胞实验,荧光显微镜及荧光酶标仪检测NET水平,DCFH-DA荧光探针孵育后荧光酶标仪检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,蛋白质印迹法检测p-MEK、MEK、p-ERK、ERK蛋白水平。结果:HCQ减轻DSS诱导的小鼠结肠炎并可抑制结肠炎模型鼠肠组织中NET形成。在细胞实验中,HCQ可抑制体外培养中性粒细胞ROS释放和NET形成,同时抑制MEK/ERK信号通路的激活。MEK激动剂C16-PAF可逆转HCQ对MEK/ERK信号通路的抑制作用,增加ROS的释放,并增加NET的形成。结论:HCQ可减轻DSS小鼠肠道炎症,机制可能是通过抑制中性粒细胞MEK/ERK信号通路,减少ROS释放,从而减轻NET导致的肠道损伤。

牙龈卟啉单胞菌脂多糖对活性中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)对活性中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响及可能的调控机制。方法:采用25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.3μg/mL P.gingivalis LPS刺激人中性粒细胞35 min,免疫荧光显微镜下观察活性NETs的形成,酶标法对胞外DNA定量,PCR法检测构成NETs的DNA来源。检测产生活性NETs的中性粒细胞感染P.gingivalis后胞内外的细菌数量,以明确NETs的杀菌效果;流式细胞术检测细胞产生的活性氧(ROS)水平;Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Raf)、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平。结果:GM-CSF+P.gingivalis LPS可促进线粒体DNA来源的活性NETs形成和胞外DNA数量的增加(P<0.05),增强中性粒细胞对P.gingivalis的杀菌活性(P<0.05)。与阴性对照组相比,GM-CSF+P.gingivalis LPS刺激的中性粒细胞ROS和Raf、MEK、ERK磷酸化水平均明显增高(P<0.05)。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂DPI处理后,GM-CSF+P.gingivalis LPS组胞外DNA数量降低,ROS水平降低(P<0.01)。结论:GM-CSF+P.gingivalis LPS可能通过Raf、MEK、ERK磷酸化调控ROS生成,促进人中性粒细胞形成活性NETs,进而促进P.gingivalis的清除,调控牙周免疫炎症反应。

血清淀粉样蛋白A诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成

目的探究血清淀粉样蛋白A(SAA)能否在体外诱导中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)。方法建立稳定的体外诱导NETs形成方法,包括外周血中性粒细胞的分离、细胞体外培养、NETs的诱导和形态学观察。提取健康志愿者的外周血中性粒细胞,分为阴性对照(NC)组、SAA组和脂多糖(LPS)组,给予相应的刺激后,观察NETs的形成并计算百分率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测培养上清中人组蛋白3(h3)的含量。结果提取的外周血中性粒细胞纯度与细胞活力均在95%以上。显微镜下观察到部分细胞的细胞核失去原有核型,向外扩散形成网状,即NETs。与NC组相比,接受SAA刺激的中性粒细胞有更多的NETs形成(P<0.05)。培养液上清中的h3含量显著高于NC组(P<0.05)。结论 SAA可在体外诱导中性粒细胞形成NETs。

HBV对中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响

目的：探讨乙肝病毒（hepatitis virus B，HBV）感染对中性粒细胞胞外诱捕网（neutrophil extracellar traps，NETs）形成的影响。方法：HBV持续感染患者和正常对照外周血各50例，化学发光微粒子免疫检测法行HBV血清标志物定量；PCR-荧光探针法行HBV-DNA定量；密度梯度离心法分离中性粒细胞，DNA定量方法测定中性粒细胞释放NETs-DNA量，NETs形成能力以PMA刺激和未刺激细胞释放的NETs-DNA比值表示。结果：PMA刺激和未刺激的中性粒细胞释放的NETs-DNA比值，HBV持续感染组为1.266＋0.2066，而正常对照组为1.460＋0.4049，其差别有统计学意义（P〈0.05）；HBsAg、HBeAg、HBcAb水平与NETs形成能力呈负相关，HBsAb水平与NETs形成能力呈正相关，而HBeAb水平和HBV-DNA载量与NETs形成能力无明显相关性。结论：HBV对中性粒细胞NETs的释放起抑制作用，病毒组分HBsAg、HBeAg和HBcAb可能参与了HBV对中性粒细胞NETs释放的负调控，其机制有待于进一步探讨。

中性粒细胞胞外诱捕网形成的分子机制及其在脓毒症中病理作用的研究进展

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞感受内外源刺激后,胞内容物外吐形成的一种由DNA骨架、组蛋白和颗粒蛋白酶组成的网状结构,其通过捕获并杀伤病原体参与机体固有免疫应答。NETs形成是多种机制驱动的一系列分子事件协同作用的结果,适量的NETs是机体清除感染的重要方式,而过量的NETs会导致组织损伤和器官功能障碍。近年来,大量研究通过解析NETs的上游调控及下游效应机制,建立起NETs与脓毒症及其相关器官功能障碍的分子关系网络,同时提出靶向NETs拯救脓毒症患者的治疗策略。该文对NETs形成的分子机制及其参与脓毒症的病理机制进行综述,同时探讨靶向NETs治疗脓毒症患者的前景与困境。

Wnt5a对中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响

目的:探讨Wnt5a对中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular trap,NET)形成的影响及可能的调控机制。方法:采用50 ng/mL Wnt5a刺激人中性粒细胞3 h,以1μg/mL牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和1μg/mL大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)LPS作为阳性对照,采用免疫荧光技术观察NET的形成,Sytox Green荧光法对胞外DNA进行定量,采用流式细胞术检测细胞产生的活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot分析信号分子磷脂酰肌醇三激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶1/2(mitogen-activated protein kinase1/2,MEK1/2)、细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)表达水平的变化。结果:Wnt5a刺激人中性粒细胞后,可观察到NET的形成和胞外DNA数量的增加(P <0.05),ROS水平较刺激前明显增高(P <0.05),Western blot检测显示,PI3K/Akt和MEK1/2、RK1/2磷酸化水平增高(P <0.05)。结论:Wnt5a可能通过PI3K/Akt、MEK1/2、ERK1/2磷酸化,调控ROS生成,进而促进人中性粒细胞形成NET。

尿酸对急性发作期痛风患者外周血中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响及其临床意义

目的比较单钠尿酸盐(monosodium urate,MSU)刺激下外周血中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)水平在痛风急性发作期的作用及其临床意义。方法收集2017年1月至2018年1月就诊于内蒙古医科大学附属医院风湿免疫科的急性发作期痛风性关节炎患者56例入组为痛风组,以及25例健康志愿者为健康对照组(HC组)。Pico Green荧光分光光度法测定血浆样品游离脱氧核糖核酸(cell-free deoxyribonucleic acid,cfDNA)含量,酶联免疫吸附剂测定法检测血浆样品中性粒细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)含量,比较MSU体外诱导下,痛风急性发作期与健康对照、治疗后缓解期外周血NETs生成水平的差异,以及与临床表现、实验室检查以及疾病活动性、严重性评分的相关性。结果在MSU的诱导下,痛风急性发作期患者的cfDNA、NE含量均显著高于健康对照组(P<0.01)。痛风急性期患者外周血中cfDNA、NE含量与痛风活动评分(gout activity score,GAS)和痛风影响量表(gout impact scale,GIS)呈高度的正相关性(r>0.6,P<0.01);缓解期患者外周血中cfDNA、NE含量较其急性发作期明显下降(P=0.001)。GAS与血浆NETs的变化(DNA,NE)显示中等程度的正相关性(r>0.5,P<0.01)。结论尿酸诱导痛风急性发作期患者生成循环NETs,可能参与加重痛风的炎症进程,本研究发现NETs的水平与急性发作期的疾病活动性及病情严重性呈正相关,有利于痛风病情的评价和监控。

耻垢分枝杆菌诱导中性粒细胞胞外诱捕网形成的研究

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是中性粒细胞抵御病原微生物重要的防御机制之一,NETs能够在体内外条件下捕获并杀灭病原微生物。为研究模式菌株-耻垢分枝杆菌(MS)与中性粒细胞的相互作用,本研究通过分离牛外周血中性粒细胞,将标记红色荧光的MS与中性粒细胞共孵育,通过激光共聚焦观察NETs的形成;采用Pi-coGreen~?dsDNA试剂盒定量分析胞外ds DNA的释放量;并且通过菌落计数统计MS的存活情况。结果显示,MS能够诱导中性粒细胞形成NETs,胞外游离DNA的释放量随着时间的延长而逐渐增多,与对照组相比差异极显著(p<0.01或p<0.001),且NETs能够杀灭MS。本研究为后续利用MS作为模式菌研究结核分枝杆菌重要蛋白功能的研究提供参考依据。

骨髓间充质干细胞对体外循环术后患者中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响及机制

目的探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对体外循环术后患者中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响及机制。方法选取2020年5—6月于首都医科大学附属北京安贞医院行体外循环手术的患者30例,分离患者术后外周血中性粒细胞(NEU),分为A组(单独培养NEU后加入二甲基亚砜反应)、B组(单独培养NEU后加入佛波酯反应)、C组(NEU与MSCs共培养后加入佛波酯反应)、D组[NEU与转染超氧化物歧化酶3(SOD3)-si RNA的MSCs共培养后加入佛波酯反应]、E组(NEU与转染对照si RNA的MSCs共培养后加入佛波酯反应),各6例。比较各组SOD3、活性氧、NETs、髓化过氧化物酶(MPO)水平及MPO活性。结果C组SOD3水平均高于A、B、D组(均P<0.05)。B组活性氧、NETs、MPO水平及MPO活性均高于A、C组[(304±23)比(52±6)、(74±6),(47811±857)μg/L比(31491±1208)、(36911±1730)μg/L,(65334±4394)ng/L比(47541±733)、(50020±374)ng/L,(0.0086±0.0011)比(0.0032±0.0002)、(0.0056±0.0010)],且D组上述指标均高于C组(均P<0.05),E组上述指标与C组比较差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论MSCs在体外可抑制NEU活性氧水平和NETs的形成,且其调控作用与其释放SOD3有关。

中性粒细胞胞外诱捕网形成的分子机制研究进展

中性粒细胞作为固有免疫的一线细胞,其死亡形式-中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)过度形成过程中因释放大量胞内成分而参与包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发生。自身免疫性疾病以自身抗原暴露、免疫耐受缺失为特征,且目前治疗仍以改善症状为主,如能抑制自身抗原产生将为其根治提供新的可能。本文主要对参与NETs形成的分子进行综述,包括ROS、PAD-4、自噬以及相关信号通路,以期促进NETs相关疾病治疗策略的开发。

细胞自噬参与中性粒细胞胞外诱捕网形成的机制研究进展

自噬是将病原体或受损的细胞器转移至溶酶体进行降解的生物学过程,对机体处理饥饿、氧化应激和防御病原体入侵至关重要。中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是由DNA和组蛋白等组成的网状结构,通过捕获、杀死、清除病原微生物来发挥其抗炎作用,但过度的NETs也可能使机体免疫系统异常活化,导致组织损伤。NETs的病理作用机制尚不清楚,但大量研究表明自噬参与其中,可能通过mTOR信号轴、PI3K、部分自噬基因及REDD1等调控参与NETs形成。本文就自噬参与NETs形成机制的研究进展做一综述,以期为揭示相关疾病的发病机制以及探索药物作用靶点提供参考依据。

中性粒细胞胞外诱捕网形成机制的研究进展

中性粒细胞主要通过吞噬、脱颗粒和产生活性氧(ROS)等方式行使功能,后来发现中性粒细胞还可以通过形成中性粒细胞胞外诱捕网(NET)参与固有免疫反应,NET的形成过程被称为中性粒细胞胞外诱捕网凋零(NETosis),属于细胞程序性死亡方式。中性粒细胞激活后,经过产生ROS、弹性蛋白酶(NE)和髓过氧化物酶(MPO)转运到细胞核,引起组蛋白修饰、染色质解凝、细胞膜破裂,形成NET,被称为依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的NETosis;不依赖NADPH的NETosis则需要肽基精氨酸脱氨酶4(PAD4)的参与;此外,还有NET快速形成过程。

中性粒细胞胞外诱捕网形成机制及其在肝脏疾病中的作用

中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)是以解聚的DNA为骨架,并与中性粒细胞颗粒蛋白组成的网状结构,是中性粒细胞除吞噬和脱颗粒作用外捕获和杀死病原体的一种新作用机制。但NETs的过量形成会对组织造成损伤,被认为是引起多种疾病的潜在因素,成为研究疾病发病机制的热点。肝脏作为重要的免疫器官,与NETs共同在隔离、清除血液循环系统细菌中发挥重要作用。NETs的形成促进了自身免疫性肝病、非酒精性脂肪性肝炎及肝细胞癌等常见肝脏系统疾病的进程。因此,NETs对肝脏疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义。

中性粒细胞胞外诱捕网形成及其在肝脏炎症中作用的研究进展

中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)是由中性粒细胞在各种刺激作用下释放到胞外的一种网状结构。它不但是机体各组织炎症时的一种免疫防御机制,而且在其过量时也可以进一步加重疾病。目前关于NETs在肝脏炎症中的作用研究较多,主要集中在医学研究。为总结NETs在肝脏炎症中的作用和为兽医研究提供思路,论文对NETs的生成机制,以及NETs在肝脏感染性炎症、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎和自身免疫性肝炎中作用的研究进展进行了综述。

PI3K/Akt信号通路在SLE患者中性粒细胞胞外诱捕网形成中的作用

目的:探讨PI3K/Akt信号通路在系统性红斑狼疮(SLE)患者中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成中的作用。方法:密度梯度离心法分离6例健康体检者外周血中性粒细胞(PMN)后,瑞士染色及台盼蓝拒染实验检测PMN的纯度及活性;加入PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002或MK2206的情况下,荧光光度法检测经佛波酯(PMA)及SLE患者混合血清分别处理PMN 90 min、120 min后NETs的形成水平,并分析各组NETs形成量的差异。结果:分离得到的PMN纯度及活性均>95%,满足体外细胞实验要求;在PMA及SLE混合血清刺激PMN形成NETs过程中,与对照组比较,加入PI3K抑制剂LY294002后,NETs生成水平降低(P<0.05);加入Akt抑制剂MK2206后,NETs形成减少(P<0.05)。在PMN自发形成NETs过程中,与对照组比较,加入Akt抑制剂MK2206后能抑制NETs形成(P<0.05),PI3K抑制剂LY294002则无此作用(P>0.05)。结论:PI3K/Akt信号通路调控NETs的形成过程,进而参与SLE的发生发展。