中性粒细胞颗粒蛋白对炎症巨噬细胞脂质运载蛋白2表达的影响

目的探讨中性粒细胞颗粒蛋白(NGP)对炎症巨噬细胞脂质运载蛋白2(LCN2)表达的影响及其机制。方法体外培养NGP高表达巨噬细胞株RAW264.7细胞(NGP/RAW细胞)和阴性对照RAW264.7细胞(NC/RAW细胞);同时提取NGP高表达小鼠和野生型C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬细胞,并体外培养。使用10 mg/L脂多糖(LPS)分别刺激上述细胞构建炎症模型(LPS组),并设磷酸盐缓冲液(PBS)对照组;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测不同类型细胞中LCN2水平,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测细胞中磷酸化信号转导及转录激活因子1(p-STAT1)的蛋白表达。另取NGP/RAW细胞和NC/RAW细胞,分别给予10 mg/L的LPS、5 mg/L的STAT1通路抑制剂氟达拉滨+10 mg/L的LPS处理,并设PBS对照组;采用ELISA法检测细胞中LCN2水平。结果在不同类型细胞中,与PBS对照组相比,LPS组LCN2水平均显著升高,并在24 h达峰值(μmol/L:NC/RAW细胞为25.61±1.02比0.46±0.02,NGP/RAW细胞为74.51±2.14比0.25±0.04,野生型C57BL/6小鼠原代巨噬细胞为10.13±0.22比0.01±0.01,NGP高表达小鼠原代巨噬细胞为28.35±0.61比0.08±0.01,均P<0.05),说明炎症反应时巨噬细胞中LCN2水平发生变化。与NC/RAW细胞相比,给予LPS刺激后,NGP/RAW细胞中各时间点LCN2水平升高更为显著(μmol/L:6 h为8.32±0.22比3.12±0.11,12 h为23.12±0.86比8.12±0.32,24 h为74.51±2.14比25.61±1.02,均P<0.05),且p-STAT1蛋白表达亦明显上调;与野生型C57BL/6小鼠原代巨噬细胞相比,给予LPS刺激后24 h NGP高表达小鼠原代巨噬细胞中LCN2水平亦显著升高(μmol/L:28.35±0.61比10.13±0.22,P<0.05)。使用STAT1通路抑制剂预处理细胞后,NGP/RAW细胞中LCN2水平较LPS组明显下降(μmol/L:6.81±0.19比22.54±0.58,P<0.05),但抑制剂对NC/RAW细胞中LCN2的生成无明显影响,与LPS组比较差异无统计学意义(μmol/L:8.04±0.20比7.86±0.15,P>0.05),说明NGP可以通过促进STAT1活化,从而上调LPS刺激后巨噬细胞中LCN2的表达。结论NGP可以通过STAT1通路正向调控炎症巨噬细胞中LCN2的表达。

中性粒细胞颗粒蛋白对脂多糖诱导巨噬细胞生成一氧化氮的影响

目的探讨中性粒细胞颗粒蛋白(NGP)对脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞生成一氧化氮(NO)的影响及其调控机制。方法体外培养NGP高表达小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞(NGP/RAW)、阴性对照空载体RAW264.7细胞(NC/RAW)、NGP敲除RAW264.7细胞(NGP KO/RAW)和野生型RAW264.7细胞(WT/RAW),取对数生长期细胞分别给予10 mg/L的LPS(LPS组)或磷酸盐缓冲液(PBS组)进行刺激。用Griess方法检测上清中NO含量;用定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA表达;用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测iNOS蛋白及磷酸化转录激活因子1(p-STAT1)蛋白表达。结果与PBS组相比,在LPS刺激后各时间点,4组细胞中iNOS mRNA表达和NO产生量均明显增加,iNOS mRNA表达于LPS刺激后12 h达峰值(2^(-ΔΔCt):NC/RAW细胞为38.45±1.34比1.00±0.00,NGP/RAW细胞为56.24±2.41比1.45±0.30,WT/RAW细胞为37.84±1.52比1.00±0.00,NGP KO/RAW细胞为5.47±0.62比0.98±0.40,均P<0.05),NO产生量于LPS刺激后24 h达峰值(μmol/L:NC/RAW细胞为24.15±1.26比0.15±0.04,NGP/RAW细胞为58.80±2.11比0.18±0.02,WT/RAW细胞为25.04±1.80比0.16±0.02,NGP KO/RAW细胞为2.42±0.38比0.12±0.03,均P<0.05)。给予LPS刺激后,NGP/RAW细胞内iNOS mRNA表达和NO生成量较NC/RAW细胞明显增加〔iNOS mRNA(2^(-ΔΔCt)):2 h为8.42±0.59比4.63±0.37,6 h为27.16±1.60比14.25±1.02,12 h为56.24±2.41比38.45±1.34;NO(μmol/L):6 h为4.12±0.25比2.23±0.17,12 h为16.50±1.52比6.35±0.39,24 h为58.80±2.11比24.15±1.26,均P<0.05〕;同时,p-STAT1和iNOS蛋白表达明显增强(p-STAT1/GAPDH:0 h为4.26±1.84比1.00±0.32,2 h为20.59±4.97比0.93±0.21,6 h为141.99±10.99比11.17±2.11;iNOS/GAPDH:0 h为1.27±0.86比1.00±0.22,2 h为7.94±1.94比2.01±0.92,6 h为24.24±4.88比3.72±1.11,均P<0.05),说明NGP可以通过促进转录激活因子1(STAT1)通路磷酸化来增加iNOS表达,进而使NO生成增多。LPS刺激后,NGP KO/RAW细胞内iNOS mRNA表达和NO生成量较WT/RAW细胞明显减少〔iNOS mRNA(2^(-ΔΔCt)):2 h为2.46±0.31比4.22±0.18,6 h为3.61±0.44比13.02±1.34,12 h为5.47±0.62比37.84±1.52;NO(μmol/L):6 h为1.22±0.19比2.01±0.12,12 h为1.60±0.44比5.15±0.62,24 h为2.42±0.38比25.04±1.80,均P<0.05〕。说明NGP敲除后iNOS活化减少,进而使NO生成减少。结论NGP可通过激活STAT1/iNOS通路正向调控活化巨噬细胞中NO的生成。

miR-223/Fosl2/NGP调控非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝纤维化作用

目的探讨miR-223/FOS样抗原2(Fosl2)/中性粒细胞颗粒蛋白(NGP)通路调控非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝纤维化的作用。方法将60只小鼠随机分成正常组、蛋氨酸胆碱缺乏(MCD)组、MCD+miR-NC组(MCD模型鼠经尾静脉注射120 nmol/kg miR-NC 100μL)和MCD+miR-223 mimic组(MCD模型鼠经尾静脉注射120 nmol/kg miR-223 mimic 100μL),每组15只。正常组给予普通饲料,其余组给予MCD饲料。酶联免疫吸附法检测4组小鼠血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平;采用放射免疫分析法检测小鼠血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C);实时荧光定量PCR检测miR-223和Fosl2 mRNA水平;观察小鼠肝脏病理变化;Western blot检测肝组织Fosl2、NGP蛋白水平。结果与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组中miR-223表达水平升高,Fosl2表达水平下降(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组肝细胞空泡化现象减少,肝细胞肥大程度降低。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组TC、TG、ALT和AST水平下降(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组中脂质滴减少(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组HA、LN和Ⅳ-C水平降低(P<0.05)。与MCD组和MCD+miR-NC组相比,MCD+miR-223 mimic组Fosl2蛋白水平下降,NGP蛋白水平上升(P<0.05)。结论miR-223可能通过调控Fosl2/NGP通路减轻NASH小鼠肝纤维化程度。