利用基因敲除技术破坏酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的初步研究

文中采用醋酸锂转化法，将一段目的基因转入到酵母体内，破坏酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因的表达。通过对目的基因的扩增和乙醇脱氢酶Ⅱ酶活检测验证基因敲除情况，并通过传代抗性试验验证突变株遗传稳定性良好。

用PCR产物直接的基因转化获得酿酒酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因突变的单倍体

在酿酒酵母中乙醇脱氢酶Ⅱ (adh2 )是受葡萄糖抑制 ,而利用乙醇的酶。通过化学转化的方法 ,把一段对遗传霉素抗性的DNA片断 ,转入酵母细胞中 ,与adh2基因的ORF(openreadingframes)进行同源重组。经过抗性筛选 ,得到一株adh2基因突变的杂和双倍体菌株。由突变的杂和双倍体菌株 ,经过形成孢子、剖分、筛选、验证 。

阿维链霉菌bkdAB的基因中断对阿维菌素合成的影响

以阿维菌B组分菌株StreptomycesavermitilisBjbm0 0 0 6为出发菌株 ,用PCR的方法构建bkdAB基因簇(Branched_chainα_ketoaciddehydrogenasegeneAB)的基因置换质粒pHJ582 1(pHZ13 58∷bkdAB&erm) ,并对其进行基因中断 ,得到重组菌株Bjbm582 1。Bjbm582 1的发酵产物经HPLC检测发现 ,除了产生B1a和B2a外 ,还产生一种原菌株没有的新组分 ,3个组分的总含量只有出发菌株Bjbm0 0 0 6的 2 5%。结果表明bkdAB的中断不仅部分阻断了阿维菌素的合成 ,还阻断了阿维菌素b组分的合成 ,可以推测bkdAB的产物在阿维菌素合成途径中主要承担了α酮基异戊酸脱氢酶 (α_ketoisovalericaciddehydrogenase)

阿维链霉菌bkdF的基因中断对阿维菌素合成的影响

以阿维菌素B组分菌株StreptomycesavermitilisBjbm0 0 0 6为出发菌株 ,用PCR方法构建支链α 酮酸脱氢酶基因bkdF(Branched chainα ketoaciddehydrogenasegene)的重组质粒pHJ5 816 (pHZ135 8 bkdF&Ermr)对其进行基因中断 ,得到重组菌株Bjbm5 816。经HPLC检测和核磁共振分析发现 ,Bjbm5 816发酵产物产生的单一组分新化合物为Oligo mycinA。

清肝活血方对酒精性肝病大鼠ADH及CYPⅡE1的影响

目的:观察清肝活血方对酒精性肝病大鼠乙醇代谢关键酶基因表达的影响。方法:用乙醇、玉米油、吡唑等制备酒精性肝病大鼠模型。RT-PCR法检测大鼠肝组织ADH及CYPⅡElmRNA表达。结果:酒粉性肝病大鼠模型表现为肝功能异常,以AST变化为显著;模型组ADH活性及其mRNA与CYPⅡE1 mRNA表达下降;高剂量清肝活血方组大鼠ADH活性及ADH与CYPⅡE1 mRNA的表达显著提高。结论:清肝活血方能显著提高模型组大鼠ADH活性及ADH与YPⅡE1mRNA的表达,促进肝脏的解毒功能。

用分子生物学法提高酵母菌产乙醇的研究

在酿酒酵母中乙醇脱氢酶Ⅱ (Adh2 )是受葡萄糖抑制 ,而利用乙醇的酶。通过乙酸锂转化的方法 ,把一段对遗传霉素抗性的DNA片断 ,转入酵母细胞中 ,与adh2基因的ORF(openreadingframe)进行同源重组。经过抗性筛选 ,得到一株adh2基因突变的杂合双倍体菌株。由突变的杂合双倍体菌株 ,通过四分体剖分 ,获得了一株adh2基因被删除的突变单倍体菌株。经过发酵实验 ,发现adh2基因被删除的突变单倍体菌株不利用乙醇。

CRISPR/Cas9介导的酿酒酵母ADH2基因中断及反义RNA干扰GPD1的表达

CRISPR/Cas9是一个简单、高效的用于靶向目的基因和无标记的基因组工程的工具。本文通过构建酿酒酵母沉默组件PGK-SGPD1-CYC1,使甘油-3-磷酸脱氢酶I(Glycerol-3-phosphate dehydrogenase,GPD1)基因在PGK强启动子、CYC1终止子在特定区域内进行干扰和表达。应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在中断乙醇脱氢酶Ⅱ(alcohol dehydrogenase Ⅱ,ADH2)基因的同时,定点敲入GPD1基因的反义干扰组件,从而特定地干扰GPD1的表达。采用高效的酵母化学转化法将反应组件敲入酿酒酵母Y1H中,CRISPR/Cas9介导的同源重组效率达43.48%,由此获得了ADH2基因中断和GPD1反义干扰的酿酒酵母突变株。发酵实验结果表明,酿酒酵母突变菌株SG1-1与出发菌株Y1H相比,乙醇产率提高了9.07%,甘油产率下降了12.05%,乙酸产率下降了12.30%,结果表明通过中断ADH2基因及插入GPD1反义干扰组件,既能够中断ADH2基因的功能,减少乙醇转化为乙醛,同时也能在一定程度上干扰GPD1基因的表达,提高乙醇产率。