NRSE与NRSF及其对神经元特异性基因表达的调控作用

神经限制性沉默元件(NRSE)是一段长度为21￣23bp的保守DNA序列,存在于许多神经元特异表达基因的转录调控区中,神经限制性沉默因子(NRSF)能特异性结合到NRSEdsDNA上,并通过其N端和C端阻遏结构域分别连接共阻遏蛋白Sin3A/B和CoREST,Sin3A招募HDAC对组蛋白进行去乙酰基化修饰,CoREST则作为平台蛋白招募特异的“沉默组件”,以此维持基因沉默.最近的研究显示,NRSEdsRNA能在转录水平与NRSF蛋白直接作用,而不是作为siRNA或miRNA在转录后水平启动神经元特异性基因的表达.

结肠特异性基因RELMβ的克隆及其真核表达载体构建

目的:观察克隆小鼠结肠特异性基因RELMβ,并构建其真核表达载体.方法:采用Western blot、Northern blot方法检测RELMβ基因在小鼠不同脏器中的表达;从小鼠结肠组织中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增RELMβ全长cDNA,克隆至T载体后进行核酸序列分析,并将其正向插入到真核表达载体pcDNA3.1/Zeo(+)的限制性内切酶位点EcoR I:重组子在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下瞬时转染小鼠胚胎纤维母细胞NIH/3T3、结肠癌细胞系CT26,Western blot及RT-PCR法检测细胞RELMβ表达水平.结果:RELMβmRNA和蛋白特异表达于小鼠结肠,而其他脏器未见表达.成功克隆了小鼠RELMβ全长cDNA(318 bp),与已报道序列的同源性高达99%,获得GenBank登录号DQ157777.真核表达载体pcDNA3.1-RELMβ转染细胞后,细胞内RELMβmRNA和蛋白水平均显著增高(P<0.01).结论:从小鼠结肠组织中克隆出RELMβ特异性表达基因,为深入研究RELMβ基因的生物学作用及其在结肠疾病靶向治疗中的作用奠定了基础.

山药块茎发育阶段基因共表达网络构建及阶段特异性分析

山药是一种药食同源作物,块茎是其主要产品器官,其发育机制对于山药产量和品质提升相关育种有着重要的指导作用。以不同生长阶段(块茎膨大第1 d、第11 d、第21 d、第31 d、第41 d、第51 d,T_(1)~T_(6))的山药块茎为材料进行转录组测序,经从头(de novo)组装后获得42042个unigenes,利用七大数据库进行注释,鉴定后发现山药块茎形成过程中涉及大量基因,包括激素合成、信号转导等相关基因。阶段特异性分析结果表明,块茎形成初始阶段为块茎发育的关键时期;加权基因共表达网络分析结果表明,在山药块茎形成初期及后期,激素相关基因的表达特别活跃,脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)是山药块茎生长发育的重要激素。研究结果为进一步研究山药块茎膨大分子机制奠定了基础。

大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关基因的组织特异性表达分析

为研究木质素合成相关基因(PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL)在大果水晶梨褐色果皮突变体中的表达特性,并为研究梨褐色果皮形成机制奠定基础。按照RNA试剂盒法提取果皮、花、叶片、果肉、枝条韧皮部中总RNA;利用DNAMAN和Primer 5.0软件设计特异引物;使用实时荧光定量PCR技术研究基因的表达。结果表明,PAL1、PAL2、CAD、POD、4CL的最高相对表达量均出现在果皮中;果皮和果肉中POD的相对表达量极显著高于其他基因,花、叶片和枝条韧皮部中CAD的相对表达量极显著高于其他基因。综上所述,大果水晶梨褐色果皮突变体木质素合成相关的5个酶基因在果皮、果肉、叶片、花和枝条韧皮部中的表达具有明显的组织特异性,这些基因可能与大果水晶梨褐色果皮的形成关系密切。

PRC1.6复合体表观遗传调控生殖谱系特异性基因的时空表达

多梳抑制复合体1 (polycomb repressive complex 1, PRC1)是一类通过催化和识别染色质表观遗传修饰进而调控基因表达的蛋白复合体,主要参与干细胞干性维持、细胞分化以及细胞周期调控等生理过程,该复合体功能异常影响机体发育或导致癌症发生。在哺乳动物细胞内,PRC1根据组成差异被进一步细分为6种不同的亚型PRC1.1～PRC1.6,它们在靶基因群识别、表观调控机制及生物学功能上存在明显特化。近年来研究发现,PRC1.6复合体在胚胎干细胞及体细胞中对于稳定抑制生殖谱系特异性基因的表达至关重要,同时对于生殖干细胞的干性维持以及精子发生过程中生殖谱系特异性基因的精密调控承担着重要作用。本文在介绍PRC1.6复合体的发现、各组分的分子功能及其参与的生化反应途径的基础上,系统阐述了该复合体在胚胎发育、性腺发育、精子发生等过程中对生殖谱系特异性靶基因群的时空表达发挥的重要调控功能,并探讨了PRC1.6与已知表观遗传调控网络的相互作用,以期为进一步探索生殖谱系基因表达、精子发生的表观遗传调控机制以及男性不育的致病机制提供参考。

神经特异性转录因子DAT1绿荧光蛋白表达载体的构建及其在C8细胞中的表达定位

目的:构建神经特异性转录因子DAT1与绿荧光蛋白融合表达的表达载体,并检测其在C8星形胶质细胞中的表达。方法:采用基因重组技术将DAT1基因和绿色荧光蛋白基因融合,构建绿荧光蛋白表达载体pEGFP-C1-DAT1,测序验证序列无误后,用脂质体法将重组质粒转入C8细胞,荧光显微镜观察DAT1的表达及定位。结果:测序验证结果表明,重组质粒含有DAT1全长编码序列,转染实验表明EGFP-DAT1能在C8细胞中正确表达,且DAT1蛋白主要定位于细胞核中。结论:DAT1全长cDNA基因绿色荧光蛋白表达载体构建成功,在C8细胞中可以正确表达,为进一步研究DAT1的功能奠定了基础。

骨形态发生蛋白-2对椎间盘细胞软骨特异性基因mRNA的调节作用

目的 探讨骨形态发生蛋白（BMP）-2对椎间盘细胞软骨特异性基因Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的调控作用。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术检测BMP-2对培养的人椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA表达的调控作用。结果 在BMP-2浓度为100μg／L（0．149±0．006，P〈0．05）和1000μg／L（0．163±0．006，P〈0．01）时，其对椎间盘细胞中Sox9基因mRNA可起到显著的正向调控作用；在此浓度下，它也可以对Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因mRNA起到正向调控作用。结论 BMP-2可以按照剂量依赖方式正向调控椎间盘细胞中Sox9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖基因的表达。

肿瘤特异性启动子驱动的RNA干扰在肿瘤基因靶向治疗中的研究

理想的肿瘤基因治疗是靶向、高效和长期稳定表达。肿瘤特异性启动子（tumor—specific promoter，TSP）是一类在肿瘤细胞中有特异性转录活性，而在正常细胞中无转录活性的启动子。由于其在肿瘤细胞中高表达，因此可驱动目的基因在靶器官组织中的特异性表达，实现肿瘤基因治疗的靶向性。

小叶杨GA20氧化酶基因的克隆、表达及单核苷酸多态性分析

利用RT-PCR方法,首次从小叶杨未成熟木质部cDNA中分离出PsGA20OxcDNA全长及其基因组DNA,并进行测序和序列分析。结果表明:克隆的小叶杨PsGA20OxcDNA片段总长为1403bp,基因内部含有完整的开放阅读框架,大小为1155bp,编码区可编码长度为385个AA残基,所推导的蛋白质氨基酸序列与拟南芥和水稻GA20Ox蛋白的同源性分别为66.0%和57.0%。组织特异性RT-PCR结果显示,PsGA20Ox基因在杨树茎、叶片和顶端分生组织中均有表达,但其表达模式却不同:PsGA20Ox在成熟木质部中表达丰度最高,在未成熟木质部和嫩叶中表达丰度较高,在顶端分生组织中有少量表达,在形成层组织中表达丰度极低。在此基础上,组合利用MEGA4.0和DnaSP4.50.4软件对小叶杨36株基因型个体的PsGA20Ox基因组DNA序列进行比对和分析,检测到49个单核苷酸多态性(SNP)位点,频率为1/35bp。其中,15个是常见SNPs,34个为罕见SNPs。在这些SNPs中,37个属于转换,12个属于颠换。在外显子区域,共检测到26个SNP位点,其中23个为同义突变,3个为错义突变。对PsGA20Ox基因内SNPs进行的连锁不平衡分析表明,随着核苷酸序列长度的增加,SNPs的连锁不平衡在基因内部就迅速衰退,因此,在小叶杨中,基于候选基因的连锁不平衡作图是可行的,而基于整个杨树基因组的连锁不平衡作图是不可行的,也是不必要的。

人类21号染色体转录调节相关基因作为早期分子诊断标记物的可行性研究

目的分析与转录调节相关的人类21号染色体(HC21)基因在小鼠植入前胚胎发育过程中的表达模式,初步阐明这些基因与早期胚胎发育的关系,发现这些基因作为分子诊断标记物的可行性。方法应用植入前胚胎的GlobalRT-PCR方法,对BACH1、RUNX1、SIM-2、ERG、KIAA0136、GCFC、SON、PKNOX1、HSF2BP和NRIP1小鼠同源基因在植入前发育阶段的表达模式进行研究。结果RUNX1、ERG和SON在整个植入前发育过程中都未见表达。其他基因的表达呈现出阶段特异性表达的特点:BACH1几乎在整个发育过程中都有表达,但是存在着胚胎个体之间的差异,不适于作为分子标记物;SIM-2只在1和2细胞期表达;Kiaa0136在2、4细胞期以外的各个阶段均表达;除了1-和2-细胞期,GCFC在其它阶段普遍表达;PKNOX1只在1、8细胞以及桑椹期表达;而HSF2BP和NRIP1的表达仅见于成熟的卵母细胞和1细胞期胚胎。结论与转录相关的小鼠HC21同源基因大部分参与了早期胚胎发育的转录调节,这些基因的阶段特异性表达说明他们参与了早期胚胎发育的不同转录调节环节,对这些基因的深入研究是认识唐氏综合症发生的分子机制和发现早期分子诊断标记的基础。

人自噬基因hAPG_(12)的克隆及其重组真核表达载体的构建

目的:探讨克隆人自噬基因h APG12 ,构建重组真核表达载体p EGFP- C2 -h APG12 ,为进一步研究h APG12 的功能奠定基础。方法:从正常人外周血单个核细胞中提取总RNA,采用两步法RT- PCR,首先把RNA逆转录为c DNA,而后通过一对h APG12 的特异性引物扩增出目的基因,PCR产物与测序载体p UC18连接后转化到大肠杆菌DH5 α,而后对单菌落进行菌落PCR、酶切和测序鉴定。将测序正确的h APG12 亚克隆入真核表达载体p EGFP-C2 ,该重组载体转化到大肠杆菌DH5 α后进行菌落PCR和酶切鉴定。结果:测序结果表明从正常人外周血单个核细胞中所获得的h APG12 c DNAs含有2 2 5个碱基,与Genbank( BC0 1 1 0 33)序列完全一致。构建的重组真核表达载体经鉴定证实h APG12 基因已完全正确亚克隆到p EGFP- C2 。结论:成功克隆了人自噬基因h APG12 并构建了具有报告基因-增强绿色荧光蛋白( EGFP)基因的重组真核表达载体p EGFP- C2 - h APG12 ,为以后研究h APG12

时空表达可控的转基因动物模型调控体系的研究

目的在血管内皮细胞建立时空表达可控的转基因动物模型调控体系。方法培育两个配套的转基因动物品系,利用组织专一性启动子确保转基因表达的空间专一性,利用四环素诱导系统对转基因表达在时间上实施调控。结果将血管内皮细胞特异性表达的VE cadherin基因启动子与人工融合的转录因子tTA基因连接,建立转基因小鼠品系VE cadherin:tTA;将tetoperon的启动子与myrAkt1连接,建立转基因小鼠品系TET:myrAkt1。两系鼠杂交的子代,筛选的阳性纯合子,能可控性地在血管内皮细胞特异性表达目的基因Akt1PKB。结论利用VE cadherin基因启动子和tet off诱导表达系统,可以达到在时间上和空间上都能人为控制目的基因在血管内皮细胞上特异性表达的目的。

皖西白鹅PIT-1基因的克隆及早期表达规律

为获得皖西白鹅PIT-1基因全部编码区序列,探明该基因在皖西白鹅早期发育阶段的表达规律,该研究分别以成年皖西白鹅基因组DNA和垂体总RNA为模板进行PCR和RT-PCR扩增、测序;采用荧光定量PCR技术分别分析皖西白鹅PIT-1基因在0周、2周、4周、7周、10周、15周和30周龄的相对表达量。结果获得了1 014bp的cDNA序列(GenBank accession number.FJ389720),其中编码区的长度为1 011 bp。同源分析结果显示:获得的编码区序列与其他物种的同源性均在60.0%以上,与鸭的同源性高达97.2%,所编码的氨基酸序列与禽类其他物种的同源性在86.0%以上。荧光定量PCR分析结果表明:初生时PIT-1基因在垂体内即有一定水平的表达;4周龄前性别间基因的表达模式存在差异;7周龄后性别间的表达模式趋于一致,表达量下降;到10周龄以后又开始上升,并在15周龄以后趋于稳定。

垂体特异性转录因子研究进展

垂体特异性转录因子（ＰｉｔｕｉｔａｒｙＳｐｅｃｉｆｉｃＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒ）于垂体前叶表达，是垂体生长激素（ＧＨ）细胞，催乳素（ＰＲＬ）细胞以及促甲状腺素（ＴＳＨ）细胞基因转录的调节者，能特异地识别基因上的ＤＮＡ序列，并与之结合，进而影响该基因转录。本文阐述已发现的两种垂体特异性转录因子（Ｐｉｔ－１和Ｐｉｔ－２），对垂体激素分泌功能及垂体疾病发病机理的重要意义。

人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定

目的:获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白. 方法:从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因,定向克隆重组入pTRX表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达,纯化,MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性. 结果:RT-PCR获得endostatin基因,扩增产物在10 g/L 琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带,约573 bp,与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,阳性克隆经KpnⅠ,NotⅠ酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体,在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达,经SDS-PAGE分析,出现特异性蛋白质条带,大小与预期相符合.重组蛋白经纯化,MTT 法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制,具有剂量依赖抑制关系,ED50=550μg/L. 结论:人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达,表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.

POU1F1基因在乾华肉用美利奴羊不同部位肌肉表达的研究

垂体特异性转录因子(Pou1f1)与动物的生长发育密切相关,本研究运用免疫组化法、荧光定量PCR及Western Blot等方法对Pou1f1在乾华肉用美利奴羊的背最长肌、胸肌和半腱肌的转录和蛋白表达水平进行了检测,研究结果表明:POU1F1蛋白在乾华肉用美利奴羊背最长肌、胸肌、半腱肌中等3个不同肌肉组织的肌纤维细胞质中均有阳性表达;Pou1f1基因在乾华肉用美利奴羊背最长肌、胸肌、半腱肌等3个不同部位的不同肌肉的mRNA和蛋白水平均差异均不显著(P>0.05),但均呈现半腱肌>胸肌>背最长肌的趋势。说明Pou1f1基因可以作为肉羊生长发育特别是肌肉发育的遗传标记。

人H_1启动子转录shRNA的细胞种属特异性研究

扬州大学王永娟、王安平、孙顺吕3位从事转基因生物制药研究工作者利用siDirect软件预测绿色荧光蛋白GFP基因特异性小干扰RNA（siRNA），将人工合成的相应shRNA插入含人H1启动子的pSuper载体，获得表达载体pSuper-shRNA，再将H1-shRNA插入表达GFP基因的peGFP-N1载体，获得表达载体peGFP-H1-shRNA。

等位基因表达不平衡及其在家养动物杂种优势中的作用

在二倍体生物中,等位基因表达不平衡(allele expression imbalance,AEI)是指同一基因位点上遗传自父本和母本的两个等位基因在表达水平上显著偏离1∶1的期望比例,从而导致亲本等位基因对子代个体生物学功能的贡献程度存在差异。尽管家养动物杂交后代在许多重要性状上表现出明显的杂种优势,但目前对相关遗传学基础和分子调控机制的了解还十分有限。文章首先从AEI发生的生物学机制和分析方法两个方面介绍了相关研究进展,讨论了AEI在家养动物杂种优势形成中可能发挥的作用及其未来的研究方向,旨在为畜禽高效配套系的选育提供一定的理论依据。

猪带绦虫六钩蚴cDNA文库的构建及免疫原基因的筛选与克隆

研究避开庞大的猪带绦虫基因组DNA,以构建六钩蚴发育阶段的cDNA表达文库为策略,利用pSPORT1质粒表达载体首次成功构建了表达文库。经库容量、重组率和代表性测定,库容量达5.0×106,重组率100%,用特异性引物能扩增出六钩蚴发育阶段10ku基因、18ku基因和45W基因家族的A型、B型、C型转录本,说明文库质量高,代表性强。应用快速筛选质粒表达文库和克隆免疫原基因的技术,成功地筛选和克隆到TsO1基因,其完整阅读框架(ORF)为393bp。将其登录到GenBank(AY327451),经BLAST分析,证实是猪带绦虫六钩蚴发育阶段的1个新免疫原基因。