应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBs^(t167)蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst167)具有相互作用的肝细胞蛋白,以探讨MHBst167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应(PCR)法扩增MHBst167基因,应用酵母双杂交系统3,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,于涂有Xαgal营养缺陷型培养基(SD/TrpLeuHisAde)上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆,提取此酵母克隆的质粒转化DH5α大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒DNA,酶切鉴定后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBst167酵母表达载体pGBKT7MHBst167。筛选出阳性菌落28个,经生物信息学分析,最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBst167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸(ALDOB)、补体3(C3)、人类血清扩散因子(生长调节素B)、人类BAC(细菌人工染色体)克隆GS1306C12。结论成功克隆出MHBst167基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBst167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究MHBst167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。

羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达

目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-MHBst和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1(-)-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。

乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。

凯氏定氮法和杜马斯燃烧法测定乳制品中蛋白质含量的比较

笔者在本文中对凯氏定氮法和杜马斯燃烧法两种方法进行比较分析,分别采用这两种方法测定乳制品中的蛋白质,通过对测定方法测定结果的比较分析两种方法的优缺点。

凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质质量控制及注意事项

目的建立适用于基层实验室的凯氏定氮法检测奶粉中蛋白质的检测方法。方法该文通过对测定奶粉中蛋白质检测方法进行全过程质量控制。结果标准样品测得值在证书给定不确定度范围内,盲样结果为满意。结论凯氏定氮法作为国标中检测食品中蛋白质的经典方法,做好检测过程的质量控制是确保检测结果准确重要保证。

超高温灭菌乳系列之四——牛乳在加热中蛋白质之变化

LTLT者赖氨酸的生理有效性减少1～2％,UHT者赖氨酸的生理有效性减少3～4％,瓶装二次灭菌者赖氨酸的生理有效性减少6～10％。

奶粉中蛋白质分析质量控制

为建立、健全各级卫生防疫站卫生理化检验质量控制机制,促进检验室规范化、科学化管理,对基层卫生防疫站进行经常性质量控制是十分必要的。 1 质控任务和要求 1.1 参加单位 白山市所辖6个县、区卫生防疫站和市卫生防疫站,由市卫生防疫站负责盲样制备、分发、数据整理等工作。

改良凯氏定氮法测定固体饮料中蛋白质

改良凯氏定氮法测定固体饮料中蛋白质江阴市卫生防疫站薛荣珍测定样品中蛋白质含量的消化过程中用硫酸铜和硫酸钾作催化剂和提高消化程度，消化时间较长。本文用加入二氧化钛以促进消化作用缩短消化时间、经对１５份样品进行了分析比较。分析的精确度都有了明显的改善和提...

样品中蛋白质、铅、砷、铜、钙、磷测定的一次性快速消解方法的研究

许多儿童营养食品既要求测定卫生指标,又要求测定营养指标。对上述项目测定国标法规定对样品处理采用分次不同方法消解,操作起来十分麻烦,既耗时,且又浪费大量试剂和电能。硫酸—双氧水快速消解法测定同一样品中蛋白质、铅、铜曾有文献介绍。笔者在此基础上,对样品蛋白质、铅、砷、铜、钙、磷测定进行一次性消化分解方法的研究,获得较为满意的结果,现报告如下: 1.实验部分 1.1 原理 样品中的有机物与浓硫酸作用发生脱水炭化作用。但消化分解沸点低。

血清SGK1水平和腹透液中白蛋白水平与腹膜透析患者血管钙化的关系

目的评估腹膜透析(PD)患者血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(SGK1)水平和腹透液中白蛋白(Alb)水平与血管钙化的相关性。方法选择2018年9月~2020年10月期间196名连续在郑州人民医院门诊接受PD治疗的患者为研究对象。通过腰椎侧位X光片评估所有研究对象的腹主动脉钙化(AAC)。收集人口统计学数据并测量生化指标,包括SGK1水平和Alb水平。通过Spearman相关系数检测SGK1和腹透液Alb与AAC评分的关系,并绘制了受试者操作特征(ROC)曲线评估SGK1水平和腹透液Alb水平检测血管钙化的能力。结果根据AAC评分,分别有108(55%)名患者没有血管钙化和88(45%)名患者有血管钙化。与AAC评分≤7组患者相比,AAC评分>7组患者的年龄、透析时间、糖尿病人数、腹透液Alb、OPG、NT-proBNP和SGK1水平显著升高(均P<0.05)。血清SGK1水平(r=0.542,P<0.01)、腹透液Alb水平(r=0.381,P<0.05)与AAC评分呈正相关。多变量线性回归分析显示,年龄、透析时间、糖尿病、SGK1水平增加和腹透液Alb水平增加为PD患者发生血管钙化的独立危险因素。SGK1水平和Alb水平检测血管钙化的ROC曲线下面积分别为0.85(95%CI=0.755~0.922,P<0.01)和0.63(95%CI=0.548~0.708,P<0.01)。结论:较高的SGK1水平和腹透液Alb水平与PD患者血管钙化相关。

中等强度运动过程中唾液中的分泌型免疫球蛋白A的变化

目的对于运动过程中唾液中SIgA的经时变化进行探讨,旨在揭示运动过程中上呼吸道局部免疫功能的变化。方法以10名健康大学生为研究对象,首先采用多阶段运动负荷试验确定好相当于60%VO 2max的心率,相隔1天后以60%VO 2max相等的运动强度进行60分钟的定量运动。在确认心率的同时调整运动负荷量以使其与60%VO 2max强度相等。唾液采集的时间是运动之前,运动开始后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟,运动结束后15分钟、30分钟、45分钟、60分钟。结果唾液分泌量与运动前相比,在运动中15分钟、30分钟、45分钟、60分钟显示出显著的减少(P<0.05),运动后15分钟以后与运动前相比没有显著差异。唾液中SIgA浓度在运动中及运动结束后,与运动前相比没有发现明显的变化。唾液中SIgA分泌量与运动前相比,在运动中15分钟、30分钟、45分钟、60分钟时显著减少(P<0.05),运动后15分钟以后与运动前相比没有发现显著差异。结论在中等强度运动中唾液中SIgA浓度没有变化,是由于唾液分泌量的降低引起唾液中SIgA分泌量的降低。

分泌型乙型肝炎病毒包膜M蛋白在毕赤酵母中的表达

将乙肝病毒包膜中蛋白M基因插入酵母整合型表达质粒pAO818的醇氧化酶 (AOX1)启动子下游 ,构建携带 8拷贝M表达盒的重组载体 ,经电穿孔转化SMD116 8菌株和G4 18筛选 ,得到了高效分泌表达M蛋白的毕赤酵母菌株 ,表达量超过 5 0mg L .经初步纯化 ,对表达产物的性质鉴定表明 ,重组蛋白具有preS2和S抗原性 ,可以形成颗粒 ,并具有一定程度的糖基化 .所构建的稳定重组菌株和所得到的重组蛋白颗粒 ,为进一步研究新一代的疫苗提供了必要的材料 .

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)结合蛋白1(MBP1)基因,构建其真核表达载体并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增MBP1基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR及限制性酶切分析及测序进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位。结果成功从HepG2细胞提取并逆转录的cDNA扩增出MBP1基因,其编码区为201个核苷酸(nt),编码产物由66个氨基酸残基(aa)组成,进行GenBank同源序列搜寻发现其与已知基因序列和蛋白序列之间无显著同源性,属于未知功能的新基因,并成功进行TA克隆,经酶切和测序验证正确后亚克隆至pcDNATM3.1/myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于第12号染色体,其编码产物分子量为16645.7,理论pI为5.33,半衰期为4.4h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含潜在的2个螺旋区域和1个β折叠,预测其可能包含2个蛋白激酶C磷酸化作用位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和2个N-豆蔻酰化位点并推测其可能具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及2个跨膜结构域。结论发现并成功克隆了乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1(MBP1)基因,为以后研究此基因的生物学功能及其在HBV损害肝细胞等方面的具体作用提供了新线索。

食品中蛋白质测定国标方法的变化及意见

目的总结食品中蛋白质测定新老国标方法的区别,有助于实验室人员更加熟悉掌握方法的变动;同时对新的国标方法提出意见和建议,利于标准方法的逐步完善。方法仔细对照新老国标方法内容的变化,列出改动的细节,并根据工作经验和工作实际,找出新国标方法可能需要补充和改进的不足之处。结果新版国标方法不但增加了新的测定方法,对原有方法的原理、试剂、测定过程、结果计算等方面的细节进行了完善与改动。结论食品中蛋白质测定新国标方法的文字表述更准确、详细,测定过程更加合理,结果计算更符合实际,但部分内容仍有待完善。

浅谈凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项

目的就凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理及注意事项进行分析。方法对凯氏定氮法测定食品中蛋白质的原理进行进一步的剖析,并对实验过程中的四个关键环节中的关键点做归纳和总结。结果该方法有取样、样品消化、蒸馏、滴定4个步骤,使用的试剂也比较多。结论实验者只有理解和掌握检验方法的原理和关键点,并在实验中加以注意,方能保证结果的准确。

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P>0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。

Ⅲ型神经中丝蛋白基因与中国高度近视人群相关性的研究

为了检测peripherin基因（PRPH）的突变与高度近视的病因有无相关关系,采用PCR-SSCP检测180例中国人高度近视先证者及60例正常人中PRPH基因所有外显子有无突变;对有突变的外显子区域进行克隆测序。结果表明,分析180例高度近视先证者PRPH基因编码区9个外显子及其邻近内含子,分别发现有下列核苷酸改变:密码子21TTC→TTT（Phe21Phe、4/180）,nt2138C→G（IVS3、1/180）,密码子277GCC→ACC（Ala277Thr、8/180）,密码子237CCA→TCA（Arg237stop、1/180）,密码子292GCG→GCA（Ala292Ala,1/180）,密码子361CUG→CUC（Leu361Leu,12/180）,密码子369AAA→AAG（Lys369Lys,12/180）,nt3331G→C（IVS7、3/180）,其中GCC277ACC为错义突变（Ala277Thr）;CCA237TCA为无义突变（Arg237stop）;密码子361CUG→CUC,密码子369AAA→AAG属于同义突变并且相连锁。Ala277Thr突变尚存在于正常人群中（1/60）,亦存在于患者正常亲属中;Arg237ston仅见于一个常染色体隐性遗传家系的患者中,为杂合性突变。分析180例高度近、视先证者PRPH基因,未发现致病突变,可排除PRPH基因与高度近视病因的相关性。在中国人群中PRPH基因有多种变异。