用免疫共沉淀进一步确定SMAD4中间连接区在形成同源和异源复合物时的作用

用酵母双杂交系统发现 SMAD4的中间连接区能与 SMAD3相互作用 ,而 SMAD4的 N区和 C区不能与 SMAD3相互作用 ,此结果与前人报道的结果有出入 .用细胞免疫共沉淀的方法进一步证实此现象 .结果与酵母双杂交的结果完全吻合 .说明 SMAD4与 SMAD3相互作用形成异源复合物时确实是通过

蛋白磷酸酶2Ac介导Smad3中间连接区去磷酸化促肾小管上皮细胞间充质转分化的研究

目的:通过蛋白磷酸酶2Ac(PP2Ac)过表达和小干扰RNA质粒转染人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)后予以转化生长因子β1(TGF-β1)刺激,观察PP2Ac对细胞外基质合成、肾小管上皮细胞间充质转分化(EMT)和Smad3中间连接区磷酸化的影响,探讨PP2Ac促肾间质纤维化的机制。方法:常规培养HK-2细胞,分为对照组、TGF-β1组和质粒转染+TGF-β1组。采用RT-PCR和Western Blot法检测PP2Ac、纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和E选择素(E-cadherin)表达水平。采用Western blot法检测Smad3、Smad3中间连接区p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达情况。结果:RT-PCR和Western Blot结果均显示:PP2Ac过表达质粒转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激24h后,PP2Ac表达较TGF-β1组升高,同时FN、Col-Ⅰ和a-SMA表达明显上调,E-cadherin表达下调;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞后再予TGF-β1刺激24h,较TGF-β1组,PP2Ac表达降低,FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达减少,E-cadherin表达增高(P<0.05)。Western Blot结果显示:TGF-β1刺激HK-2细胞1h时PP2Ac和Smad3中间区磷酸化的蛋白表达均达到峰值;HK-2细胞转染PP2Ac过表达质粒再予TGF-β1刺激1h后,与单纯TGF-β1刺激组比较,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)表达均下降;而PP2Ac小干扰RNA转染HK-2细胞再予TGF-β1刺激1h后,核蛋白中p Smad3-L(p Ser204)和p Smad3-L(p Ser208)蛋白表达均增加(P<0.05)。结论:PP2Ac促进肾小管上皮细胞外基质的生成及EMT;PP2Ac介导肾小管上皮细胞Smad3中间连接区去磷酸化。

去甲斑蝥素抑制蛋白磷酸酶2Ac对Smad3-L区去磷酸化抗肾间质纤维化

目的 证实去甲斑蝥素（NCTD）具抗肾间质纤维化的作用,其抗肾间质纤维化的机制与靶向抑制蛋白磷酸酶2Ac（PP2Ac）对Smad3中间连接区（Smad3-L）的去磷酸化修饰有关.方法 常规培养人肾小管上皮细胞（HK-2）,转染PP2Ac shRNA质粒后,细胞分为5组：（1）空白组;（2）TGF-β1（5μg/L）组;（3） TGF-β1 ＋NCTD （2.5 mg/L）组;（4）TGF-β1＋PP2Ac shRNA组;（5）TGF-β1＋PP2Ac shRNA＋NCTD组.采用实时荧光定量PCR和Western印迹检测PP2Ac、纤维连接蛋白（FN）、胶原蛋白Ⅰ （Col-Ⅰ）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）和E-钙黏蛋白（Ecadherin） mRNA及蛋白的表达.然后将HK-2细胞随机分为3组：（1）空白组;（2）TGF-β1组;（3）TGF-β1＋NCTD组,采用免疫荧光检测pSmad3-L（Ser204）和pSmad3-L（Ser208）在HK-2细胞的分布,Western印迹检测HK-2细胞核蛋白pSmad3-L（Se204）和pSmad3-L（Ser208）的表达.结果 （1）TGF-β1促进HK-2细胞PP2Ac表达,同时上调FN、Col-Ⅰ和α-SMA的表达,下调E-cadherin 的表达.NCTD和PP2Ac shRNA均抑制PP2Ac的表达,下调FN、Col-Ⅰ和α-SMA表达,上调E-cadherin的表达.但NCTD与小干扰RNA共同作用对PP2Ac表达的抑制,以及对TGF-β1诱导的上述指标的改变程度同单纯PP2Ac小干扰RNA干预组无明显差异.（2）TGF-β1刺激HK-2细胞核内pSmad3-L（Ser204）、pSmad3-L（Ser208）表达明显增多,NCTD干预使pSmad3-L（Ser204）、pSmad3-L （Ser208）在细胞核内表达进一步增多.结论 NCTD通过抑制PP2Ac介导的Smad3-L区去磷酸化,发挥抗肾间质纤维化作用.