转晚期胚胎发生丰富蛋白(LEA)基因棉花及抗旱性分析

本研究将紫杆柽柳(Tamarix and rossowii Litv)晚期胚胎发生丰富蛋白(LEADQ663481)基因导入新疆早熟棉新陆早18号,通过冬季海南加代、夏季新疆继代的方法获得T3代转基因棉花株系。从40株大田卡那霉素检测阳性植株中,经过PCR筛选证明3株为阳性的转化株。在室内条件下,对转化株幼苗进行水培实验,并用12%(w/v)PEG-6000处理12h模拟干旱胁迫。结果显示,干旱胁迫之后,转LEA基因棉花基因表达量显著增加;丙二醛生成量显著降低;游离脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的生成量显著增加;棉花表型分析也证明了转LEA基因棉花抗旱性有提高。培养45d后,转LEA基因棉花的生物量高于非转基因棉花。本研究结果表明,在干旱胁迫条件下,转LEA基因棉花表现出了优良的生长和生理优势,显示出转LEA基因棉花能提高棉花的抗旱能力。

沙冬青胚胎晚期发生丰富蛋白基因序列及表达特性分析

从沙冬青叶片EST文库中获得了胚胎晚期发生丰富蛋白(LEA)基因cDNA全长序列,命名为AmLEA14。序列分析表明该基因全长579bp,含有一个459bp编码152个氨基酸的开放阅读框,推测编码的蛋白质分子质量为16.6ku。二级结构预测显示此编码蛋白属于第4类LEA蛋白。系统发生分析表明,此编码蛋白与大豆LEA14蛋白(P46519.1)的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,AmLEA14的表达量在低温、干旱、盐胁迫条件下升高,但是主要在低温胁迫后期富集。推测AmLEA14基因可能在沙冬青抵御低温、干旱、盐胁迫中发挥作用,主要是参与沙冬青的低温防御机制。

巴西橡胶树胚胎晚期丰富蛋白基因的克隆及序列分析

根据抑制性消减杂交文库分离的EST片段,采用3'-RACE技术从巴西橡胶树胶乳中获得HbLEA14基因的全长cDNA序列,其ORF长456 bp,编码151个氨基酸,预测HbLEA14蛋白分子量为16.58 ku,等电点为5.10。同源性比对显示,HbLEA14与蓖麻RcLEA14、乳浆大戟EeLEA14、陆地棉GhLEA14、大豆GmLEA14、拟南芥AtLEA14、番茄SlER5的同源性分别为88%、80%、75%、73%、65%和61%,属于非典型第2组LEA蛋白。RT-PCR结果显示,死皮植株胶乳中HbLEA14的表达量明显高于健康树。

植物胚胎发育晚期丰富蛋白的结构与功能

胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)是植物在逆境条件下生成的一类应激蛋白,它可以通过稳定细胞膜、结合金属离子等机制提高植物的抗逆性。笔者对植物LEA蛋白的分类及其相应的结构,以及LEA蛋白响应干旱、低温及其他胁迫响应中功能的研究进展进行了综述。

海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因SpLea5的克隆与表达分析

根据筛选文库时获得的EST序列信息,利用RACE技术从海马齿根中分离获得了一个海马齿胚胎发育晚期丰富蛋白基因的全长cDNA,命名为SpLea5。序列分析结果表明,SpLea5基因cDNA全长685 bp,含有一个294 bp的完整开放阅读框,编码97个氨基酸残基;推测编码的氨基酸序列与柽柳、杨木樨、烟草、甜橙、温州蜜柑、麻风树和陆地棉中相应基因的氨基酸序列一致性为54%、52%、48%、47%、47%、46%、44%、41%,在聚类分析时与高等植物聚为一类。SpLea5在海马齿植株中呈组成型表达,但根中表达最为丰富,茎和叶次之;海水、NaCl、PEG、ABA处理均能够诱导根部SpLea5基因的表达。这些结果表明,SpLea5基因可能参与了海马齿对盐和干旱胁迫的分子响应。

花生胚胎发育晚期丰富蛋白基因AhLEAL的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

低温、高盐和干旱等非生物胁迫严重影响花生的生长和产量,而花生中有关非生物胁迫的研究及抗性基因的挖掘较少。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant,LEA)是一类亲水性蛋白,其功能主要是参与调控植物应答脱水相关的非生物胁迫包括耐盐、抗旱和抗冻等。本研究以花生品种花育33号为试验材料,根据cDNA文库中已知的胚胎发育晚期丰富蛋白基因全长序列设计引物,通过RT-PCR克隆到该基因。该基因全长为555bp,开放阅读框为291bp,编码97个氨基酸。核苷酸序列比对表明,该基因与花生中已注册基因AhARG2(XM_016113504)同源性为100%,与AhLEA6-1(HM543588)同源性为99%。蛋白序列比对分析表明,该基因编码的蛋白与Genbank上已经注册的沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)、牧豆树(Prosopis juliflora)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等植物中的胚胎发育晚期丰富蛋白同源性达到近65%。我们将该基因命名为AhLEAL(Arachis hypogaea Late Embryogenesis Abundant Like)。预测该基因编码的蛋白可能定位于细胞液、线粒体、内质网和叶绿体中。荧光定量PCR结果显示,AhLEAL在花生叶片和根中的表达受低温和高盐胁迫的强烈诱导,在根中受干旱胁迫的强烈诱导,说明该基因可能参与了花生对三种非生物胁迫的适应性调控;此外,AhLEAL在花生叶片和根中的表达也明显受ABA的诱导,说明该基因对花生逆境胁迫的调控可能是以依赖ABA的方式进行的。

回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元、基质金属蛋白酶-14、内皮抑素及血管内皮生长因子在喉癌中的表达及相关性研究

目的观察回复引导半胱氨酸丰富蛋白Kazal基元(RECK)、基质金属蛋白酶-14(MMP-14、)、内皮抑素(Endostatin)及血管内皮生长因子(VEGF)在喉癌中的表达,并对其相关性进行分析。方法应用流式细胞检测仪检测40例喉癌患者的喉癌组织(喉癌组)、癌旁组织(癌旁组)及喉部正常黏膜组织(对照组)中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表达水平,并统计分析其表达与喉癌临床病理因素的关系及其之间的相关性。结果在喉癌组织中,RECK、Endostatin的蛋白FI表达量显著低于癌旁组及对照组(P<0.05);MMP-14及VEGF蛋白的FI表达量显著高于癌旁组及对照组(P<0.05)。喉癌组织中RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF蛋白的FI表达量与喉癌组织的转化程度、是否发生淋巴结转移及临床分期病理组织学分级密切相关(P<0.05),但与年龄的关系不密切(P>0.05)。表达相关性结果显示,喉癌组织中RECK与MMP-14表达呈负相关(r=-0.765,P<0.03),喉癌组织中Endostatin与VEGF蛋白的表达呈负相关(r=-0.563,P<0.04)。结论 RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF有可能参与喉癌的发生、发展、分化及转移,并呈现出一定的相关性,联合检测RECK、MMP-14、Endostatin及VEGF的表达,可能有利于临床对喉癌的诊断。

玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因的启动子克隆与功能验证

该研究在生物信息学分析的基础上,克隆玉米胚胎发生后期丰富蛋白基因(MGL3)的启动子序列(pMGL3),进行非生物逆境应答元件分析以及实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性,构建了pMGL3启动子驱动报告基因(GUS)表达载体,基因枪法转化玉米愈伤组织,通过GUS染色验证pMGL3启动子在非生物逆境胁迫下的驱动活性。再根据启动子序列分析结果,去除不同的顺式作用元件,构建不同长度pMGL3启动子驱动报告基因GUS表达载体,农杆菌介导法转化烟草叶盘,以确定pMGL3启动子的最短活性序列。结果显示:pMGL3启动子长1 554bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,在干旱、高盐、低温胁迫及脱落酸、乙烯诱导下驱动MGL3基因增量表达,用以驱动GUS基因转化玉米愈伤组织,在高渗、高盐、低温胁迫及脱落酸诱导下具有驱动活性,且截短至325bp仍可保持驱动活性。研究表明,pMGL3启动子的确有非生物逆境诱导启动活性,进一步验证其作用机理后可运用于玉米抗逆转基因研究。

半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白1对膀胱癌细胞增殖、细胞周期及β-catenin/c-Myc通路的影响

目的分析半胱氨酸和甘氨酸丰富蛋白1(CSRP1)对膀胱癌细胞增殖、细胞周期及β-catenin/c-Myc通路的影响。方法采用免疫组化法、蛋白质印迹(Western blot)法和实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)法分别检测膀胱癌组织和细胞中CSRP1的表达水平,并分析CSRP1与膀胱癌患者预后的关系。通过转染小干扰RNA下调膀胱癌细胞中CSRP1的表达水平,采用MTS细胞增殖实验、流式细胞术探讨CSRP1表达对膀胱癌细胞增殖及细胞周期分布的影响。采用实时荧光定量PCR和Western blot法分析CSRP1表达对β-catenin/c-Myc信号通路的影响。结果CSRP1在膀胱癌组织中呈高表达,且CSRP1高表达与患者预后不良有关。膀胱癌细胞中CSRP1mRNA和蛋白表达水平均高于人正常尿路上皮细胞(P﹤0.05)。沉默CSRP1后,T24细胞增殖能力降低,细胞周期出现G1/S期阻滞,β-catenin/c-Myc通路受到抑制。结论CSRP1在膀胱癌细胞中发挥促癌作用,可能通过β-catenin/c-Myc通路促进膀胱癌进展。

半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1-骨形态发生蛋白4信号通路对血管紧张素Ⅱ诱导的心室肌细胞肥大的调控作用研究

目的探讨半胱氨酸丰富跨膜成骨蛋白调控因子1(Crim1)是否通过抑制骨形态发生蛋白4(BMP4)而调节血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心室肌细胞肥大。方法分离1 d龄SD大鼠乳鼠心室肌获心室肌细胞,按干预方式不同分九组:Ad-Null(腺病毒空载体)组、Ad-Null+AngⅡ、Ad-Null+AngⅡ+Nog(重组人头蛋白)组、Ad-Crim1(Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-Crim1+AngⅡ组、Ad-Crim1+AngⅡ+Nog组、Ad-shCrim1(shRNA干扰介导沉默Crim1基因重组腺病毒载体)组、Ad-shCrim1+AngⅡ组和Ad-shCrim1+AngⅡ+Nog组。实时荧光定量逆转录PCR检测β-肌球蛋白重链(β-MHC)和BMP4的mRNA表达。Western免疫印迹法检测全细胞提取蛋白BMP4的表达。细胞经结晶紫染色后通过Image J软件测量细胞表面积。结果AngⅡ干预明显增加心室肌细胞β-MHC mRNA表达以及细胞面积,上调BMP4 mRNA/蛋白表达;Ad-Crim1和Nog干预明显抑制AngⅡ的上述效应。Ad-shCrim1干预沉默Crim1基因对心室肌细胞β-MHC mRNA表达,细胞面积及BMP4 mRNA/蛋白表达与AngⅡ干预效应相似,该效应为Nog干预明显抑制。结论Crim1通过下调BMP4的表达而抑制AngⅡ诱导的乳鼠心室肌细胞肥大。

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅(Chimonanthus praecox)花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白(LEA)基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA(GenBank登录号:JF412788),该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸(ABA 50μmol·L-1)、低温(4℃)、高温(42℃)、干旱(30%PEG6000)和高盐(NaCl 1 mol·L-1)5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。

辛二酰苯胺异羟肟酸对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元以及基质金属蛋白酶9表达与活性的影响

目的探讨辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)对鼻咽癌细胞回复引导半胱氨酸丰富蛋白含kazal基元(reversion-inducing-cysteine-rich protein with kazal motifs,RECK)以及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)表达与活性的影响。方法体外培养鼻咽癌细胞系CNE-1,用0、0.1、1、5μmol/L SAHA处理后,采用蛋白质印迹法(Western blot)和Real-Time PCR(RT-PCR)分别检测RECK,MMP-9蛋白和mRNA表达;MTT法检测CNE-1细胞的增殖。同时采用明胶酶谱实验观察SAHA处理后MMP-9酶活性变化。结果随着SAHA浓度的增加,RECK蛋白和mRNA的表达显著增高(P<0.05);随着SAHA浓度的增加,MMP-9蛋白和mRNA的表达显著降低(P<0.05);CNE-1细胞随着SAHA浓度的增加,存活率逐渐降低(P<0.05)。明胶酶谱实验显示,随着SAHA浓度的增加,MMP-9酶活性逐渐降低。结论 SAHA可能通过上调RECK基因的表达,抑制MMP-9的表达与活性而发挥对CNE-1细胞生长抑制作用。

香蕉胚胎发育晚期丰富蛋白(MaLEA)家族生物信息学分析

晚期胚胎发育丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein,LEA)普遍存在于植物中,该家族蛋白在非生物胁迫下大量积累以保护植物正常生长发育。为了探索MaLEA家族蛋白在调控香蕉非生物胁迫中的功能,本研究利用生物信息学方法对23个香蕉LEA家族的基因结构、理化性质、亚细胞定位、系统进化、表达特性及启动子进行初步研究。结果显示:MaLEA家族属于高度亲水蛋白,等电点在4.6~9.96之间,大多数定位于细胞质,同时在细胞核、叶绿体和线粒体也有分布。聚类分析发现MaLEA家族共分为7组,不同组间Motif存在一定差异;在启动子序列中,内含子数目为0~3。转录组数据显示,大多数MaLEA家族成员在香蕉果实发育的前期表达量较高;同时,MaLEA3、MaLEA5、MaLEA14和MaLEA23响应了干旱、盐和冷胁迫。进一步分析MaLEA家族基因启动子区响应元件,发现大量响应盐、干旱、高温、低温胁迫、机械损伤和茉莉酸甲酯、脱落酸激素等的顺式作用元件,推测MaLEA家族在非生物胁迫中发挥着重要作用,为深入研究香蕉MaLEA家族基因的功能提供了基础数据。

含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白1的研究进展

含半胱氨酸和组氨酸丰富域蛋白1(CHP-1/Morgana)由CHORDC1基因编码,对维持生物正常发育起重要作用,其缺失可导致不育或者胚胎死亡。CHP-1是具有调节锌离子能力的金属调节蛋白,可通过抑制ROCK激酶抑制中心体的复制,可在细胞缺血应激过程中保护细胞,避免凋亡。CHP-1通常依赖ADP和热激蛋白90与核苷酸的作用,其异常表达与许多癌症的发生密切相关。CHP-1减少可增加部分肿瘤(如三阴性乳腺癌、肺癌等)的易感性,造成细胞有丝分裂障碍,与多倍体细胞形成有关,未来将成为抑制肿瘤发生、发展的新靶点。

RECK和基质金属蛋白酶与恶性肿瘤预后的研究进展

伴有kazal基序富含半胱氨酸的逆转诱导蛋白(reversion-inducing cysteine-rich protein with Kazal motif,RECK)基因是新近发现的基质金属蛋白酶(matrix matalloproteinase,MMP)抑制剂,能在转录后水平抑制多种MMP的表达而抑制肿瘤的侵袭及转移。RECK与乳腺癌、胰腺癌、骨肉瘤等疾病患者的预后存在正相关关系。文中综述RECK和MMP与各系统肿瘤的关系。

花生AhLEA18蛋白基因的克隆与表达分析

LEA蛋白家族是一类在种子胚胎发育晚期丰富表达的蛋白,在种子的正常发育过程中大量积累,同时在植物处于干旱、寒冷、盐胁迫等逆境条件下高水平表达,推测该类蛋白在缺水条件下具有一定的生理保护功能。根据蛋白序列特点,该蛋白家族分为多个组,LEA18蛋白属于其中一组蛋白。PvLEA18蛋白在干燥种子、花粉粒中大量积累,也参与到对水分缺失、ABA处理的生理应答过程。该文从栽培种花生鲁花14中克隆得到一个LEA18基因,命名为AhLEA18。对其序列的生物信息学分析表明,AhLEA18具有典型LEA18蛋白序列特征。通过半定量RT-PCR的方法对该基因在花生植株不同组织及不同发育时期的种子中的表达情况进行了分析。

野生茄托鲁巴姆LEA蛋白基因的克隆与序列分析

野生茄托鲁巴姆高抗黄萎病,是研究茄子黄萎病抗性的理想试材。胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA蛋白)是植物在逆境条件下生成的一类应激蛋白。研究以1个受黄萎病菌诱导的托鲁巴姆EST为种子序列,结合电子克隆及RT-PCR验证的策略,获得了LEA蛋白基因的全长cDNA序列,命名为StLEA1。该基因的完整开放阅读框为291 bp,编码96个氨基酸,编码蛋白的分子量为10.748 kDa,等电点为9.913。经序列分析,StLEA1为水溶性蛋白,不存在信号肽,具有LEA5家族的典型结构域和保守序列,预测含有多个磷酸化位点。表达分析表明,托鲁巴姆受黄萎病菌侵染后,StLEA1在根系中上调表达。为探讨野生茄托鲁巴姆抗黄萎病分子机制提供了素材。

丹参晚期胚胎蛋白基因SmLEA的克隆及表达分析

对丹参EST序列进行Blast分析,发现一条序列与晚期胚胎丰富蛋白(late embryogenesis abundant)基因有较高的相似性,在此基础上设计引物,分别从cDNA和gDNA水平克隆到该基因的全长(Genbank注册号:AY725206),命名为SmLEA。该序列全长739 bp,无内含子,包含1个长为495 bp的开放阅读框,编码164个氨基酸。序列比对结果显示,该序列与番茄的晚期胚胎丰富蛋白Lemmi9有较高的相似性(69%),推测该编码蛋白属于晚期胚胎蛋白LEA14家族成员。生物信息学显示,SmLEA所编码蛋白SmLEA的相对分子质量为17.34 kD,理论等电点为4.51,富含天冬氨酸及AS、IP、KV、VS、TIP肽段,定位于细胞质中,为稳定类蛋白。实时荧光定量PCR结果显示,该基因在丹参的根、茎、叶中均有表达,为组成型表达基因。

RECK蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其与MMP-9的关系

目的:探讨RECK和MMP-9在非小细胞肺癌组织及非癌组织中的表达及两者之间的关系。方法:选择非小细胞肺癌组织50例,同时选取20例非癌肺组织,采用免疫组化SP法检测RECK和MMP-9在癌组织和非癌肺组织中的表达。结果:RECK蛋白表达主要位于细胞浆,其在癌组织中低度表达,而在非癌肺组织中呈高度表达(P<0.001);MMP-9蛋白表达主要位于细胞浆,其在癌组织中高度表达,而在非癌肺组织中呈低度表达(P<0.001)。在癌组织中,RECK和MMP-9的表达与患者的年龄、性别、吸烟指数、病理类型、分化程度无明显关系,与是否有淋巴结转移及TNM分期有关。关联性分析提示,两者呈负相关关系(χ2=27.273,r=-0.739,P<0.001)。结论:在非小细胞肺癌组织中RECK低表达,MMP-9高表达,两者呈负相关关系。

非小细胞肺癌组织中RECK蛋白的表达及与预后的关系

目的探讨非小细胞肺癌组织中RECK的表达及其与预后的关系。方法采用免疫组化SP法检测RECK在48例肺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,通过Kaplan-Meier生存曲线法比较阳性组和阴性组患者的预后情况。结果肺癌组织中RECK表达阳性率为29.2%(14/48),在癌旁正常肺组织中阳性表达率为85.7%(42/48),两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。RECK的表达与淋巴结转移和TNM分期有关,而与患者年龄、性别、肿瘤大小、组织学分化程度无关。与无淋巴结转移和Ⅰ、Ⅱ期的肺癌组织相比,在有淋巴结转移和Ⅲ期的肺癌组织中,RECK的阳性表达显著性降低(P<0.05)。RECK蛋白阴性组的患者的生存期较阳性组短,统计学上有显著性差异(P=0.018)。结论RECK蛋白在肺癌中具有低表达,在肺癌的侵袭和转移中发挥重要作用,并与肺癌患者的预后相关。