串珠镰孢霉D-泛解酸内酯水解酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

利用D_泛解酸内酯水解酶N末端序列,并根据NCBI中公布的D_泛解酸内酯水解酶cDNA序列设计了一个特异引物,该引物结合Oligo(dT) 1 5,以串珠镰孢霉(Fusariummoniliforme)CGMCC 0 5 36mRNA反转录得到的总cDNA为模板进行扩增,获得约1 5kb左右的片段,将其克隆到T载体上进行测序,对测得的序列进行分析,重新设计了一对引物,并在引物两端分别加上限制酶EcoRⅠ和SalⅠ的识别位点序列,利用热启动PCR成功地扩增出了D_泛解酸内酯水解酶基因,基因片段长度为114 6bp ,该序列同来源于尖镰孢霉菌(F .oxysporum)AKU 370 2菌株的编码D_泛解酸内酯水解酶cDNA结构基因的同源性为90 0 6 %。将所得片段定向克隆到pTrc99a载体中,转化至JM10 9感受态细胞,筛选出了阳性克隆。经IPTG诱导阳性菌,进行SDS_PAGE电泳,检测出在约4 0kD处有一蛋白表达带。对两株重组基因工程菌的比活力进行测定,结果分别为37U和4 1U。

D-泛解酸内酯水解酶的定向进化

易错PCR结合DNA改组方法向D泛解酸内酯水解酶基因中引入突变,并构建突变体库。利用酶的催化特点和产物特性建立了基于平板初筛和高效液相复筛的两步法D泛解酸内酯水解酶活性筛选系统。用该筛选系统以酶活力和pH稳定性为指标对突变体库进行筛选,最终获得一株酶活力高且在低pH条件下稳定性好的突变体MutE861。该突变体的酶活力是野生型酶的5.5倍。对突变体和野生型酶在pH6.0和pH5.0条件下的残余酶活进行对比,在这两种pH条件下,突变体酶的酶活残留分别为75%和50%,而野生型酶只能保持原来的40%和20%。通过软件对突变体MutE861酶基因和野生型酶基因进行分析对比,发现突变体MutE861酶基因发生了三处点突变,其中突变使两处氨基酸取代,另一处为沉默突变,未引起氨基酸的变化。

固定化细胞拆分DL-泛解酸内酯的初步研究

用卡拉胶包埋串珠镰孢霉菌FusariummoniliformeSW - 90 2菌丝体 ,得到D -泛解酸内酯水解酶活力较高的固定化细胞。与游离细胞相比较 ,固定化细胞酶活随 pH变化的范围以及对温度适应的范围大致与游离细胞相仿。用固定化细胞进行反复分批酶水解 30批 ,每天一批 ,酶活稳定 ,平均水解率 2 8.0 %。固定化细胞冰箱 (4℃ )贮存 8周 ,酶活未见下降。

微生物酶拆分方法生产D-泛酸的手性中间体D-泛解酸内酯

筛选到一株产D -泛解酸内酯水解酶的串珠镰孢霉菌 (FusariummoniliformeSW -90 2 )。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始 pH8.0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L和 10 0 0L发酵罐中通风发酵 4 5～ 4 7h ,产酶量为 6～ 8g干菌体 /L ,D -泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 .87～ 0 .92IU/g干菌体。该酶的最适反应温度为 5 5℃ ,最适反应 pH为 7.0～ 7.5。在酶不对称水解泛解酸内酯过程中 ,对溶液加酶量 5 %～ 10 % ,底物浓度 10 %～ 2 0 % ,控制水解率 2 0 %～ 30 % 。

D-泛解酸内酯水解酶产生菌的筛选及产酶条件研究

筛选到一株产D 泛解酸内酯水解酶的菌株 ,经鉴定为串珠镶孢霉菌 (Fusariummonili forme)SW 90 2。产酶条件研究表明 ,用甘油作碳源 ,蛋白胨作氮源 ,初始pH8 0 ,温度 2 6℃ ,摇瓶培养 3d ,产酶量最高。在 6 0L发酵罐中通风发酵 45h ,产菌丝体生物量 7 1 8g干菌体 L ,D 泛解酸内酯水解酶酶活力达到 0 92IU