人肠三叶因子串联亲和层析表达载体的构建与表达

背景:人肠三叶因子为新型的生长因子,可促进细胞生长与迁移,并使细胞具有很强抗凋亡能力,在维持胃肠黏膜完整性、黏膜保护与损伤修复发挥着重要作用,与胃肠道等多个肿瘤的发生发展密切相关。人肠三叶因子(三叶因子3)在黏膜修复及作为肿瘤标志物有着广阔的临床应用前景,但其相互作用蛋白及具体分子机制不明确。目的:构建和表达带串联StrepI I和6×His两个蛋白标签的三叶因子3重组蛋白,以进一步利用研究体内蛋白质相互作用的串联亲和层析技术纯化获得三叶因子3相互作用蛋白。方法:化学合成用于串联亲和层析的标签(StrepI I-TEV-6×His)基因序列,并以三叶因子3表达载体为模板,PCR扩增三叶因子3基因序列,通过Xba I位点实现标签与三叶因子3基因序列的融合,并将标签置于三叶因子3蛋白的C端,融合基因通过EcoR I+Hind III酶切,克隆于表达载体pC DNA3.0,构建了三叶因子3串联亲和层析表达载体pT FF3-C-StH。表过载体通过脂质体瞬时转染胃癌细胞AGS,采用Western Blot检测重组蛋白的表达。结果与结论:成功构建了三叶因子3串联亲和层析表达载体pT FF3-C-StH,经酶切和测序鉴定载体构建完全正确。表达载体成功转染胃癌细胞株,并获得重组蛋白的表达,通过Western Blot检测证明表达产物具有很好的抗原性和特异性,为串联亲和层析纯化三叶因子3相互作用蛋白提供重要的实验基础和工具。

串联亲和纯化技术筛选hCLP46的相互作用蛋白

hCLP46(human CAP10-like protein46)是从MDS-AML患者的CD34+干细胞cDNA文库中筛选出的基因.我们利用串联亲和纯化技术来筛选与hCLP46有相互作用的蛋白.通过体内交联-甘氨酸洗脱策略,检测到7条有差异的蛋白带,经液相色谱-质谱联用鉴定,得到了CNX和PDI等一系列内质网伴侣蛋白.所以hCLP46可能是一个糖蛋白,其成熟过程利用了BiP/Grp94和CNX/CRT 2套伴侣蛋白系统.