苏云金芽孢杆菌分子伴侣串联基因p19-p29的克隆和表达载体的构建

根据已知序列设计一对PCR引物 (ORF 5S ,ORF 3N) ,可从cry2Aa或cry2Ac操纵子中扩增出包含串联分子伴侣基因p1 9 p2 9的DNA片段 ,预期大小分别为 1 6kb和 2 0kb。对 1 5 0株苏云金芽孢杆菌菌株进行PCR检测 ,从 2 6株中获得了大小为 1 6kb的扩增片段 ,但未获得2 0kb的片段。这表明cry2Aa型操纵子p1 9 p2 9基因存在较广泛 ,而cry2Ac型较罕见。将来自Y2 菌株的 1 6kb片段回收 ,通过一系列亚克隆 ,最终构建成一个含有p1 9 p2 9串联基因的Bt表达载体 ,为进一步研究p1 9 p2

新城疫强毒株F蛋白裂解位点串联基因的构建及其原核表达

目的构建鸡新城疫(ND)强毒株多裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法奠定基础。方法人工合成一段包含4种不同NDV强毒株裂解位点的基因Fe(F prote in multitude epi-position),其中各裂解位点之间用Linker(GGGGS)使其串联,然后进行2倍和4倍拷贝,并定向克隆至原核表达质粒pET-28a(+)中,构建重组表达质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28a(+)/4Fe,进行表达和Western blot鉴定。结果构建的原核表达重组质粒pET-28a(+)/2Fe和pET-28 a(+)/4Fe测序正确。Western blot检测结果表明,2Fe、4Fe蛋白均与新城疫强毒株F48E9阳性血清呈阳性反应,而与新城疫弱毒株V4阳性血清呈阴性反应。结论已成功构建NDV强毒株F蛋白裂解位点串联基因表达载体,为建立NDV强弱毒株的ELISA鉴别方法提供理论依据。

三种呈味肽串联基因的构建和表达

通过对呈味肽GD、AD、VD结构的分析,引入甲酸和胰蛋白酶的专一性位点,设计了呈味肽的串联单体。根据大肠杆菌偏嗜密码子设计并合成寡核苷酸片段,利用拼接法合成此三种肽的8拷贝片段,将其克隆至表达载体pET-30a并转化到宿主菌BL21(DE3)中。筛选的阳性克隆经测序表明,本研究已成功构建了重组呈味肽工程菌BL21-pET30-8GD、BL21-pET30-8AD、BL21-pET30-8VD。IPTG诱导的菌体总蛋白和破碎液上清的纯化物经Tricine-SDS-PAGE电泳检测,证明目的基因得以成功表达。

抗菌肽(tachyplesin Ⅰ)串联基因的构建、表达及抗菌活性

为了实现通过基因工程方法制备具有稳定结构的抗菌肽tachyplesinⅠ,采取了tachyplesinⅠ基因串联表达的方法。实验以高拷贝穿梭表达载体pSBPTQ为表达载体,通过RT-PCR扩增tachyplesinⅠ基因(tac)和采用直接退火的方法合成tachyplesinⅠ串联基因(2tac)。构建重组表达载体pSBPTQ-TAC和pSBPTQ-2TAC,转化到枯草杆菌WB800实现高效表达,经2%蔗糖诱导获得表达串联产物(2TAC)和TAC。通过离子交换柱层析纯化后得表达产物2TAC和TAC,2TAC经BrCN水解后,对表达产物抑菌活性分析,观察发酵液上清对大肠杆菌(E.coli K88)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的抑菌圈和细胞微观形态的变化。实验结果表明:基因tac和2tac在枯草杆菌中表达成功,表达产物在发酵上清液中的含量分别约为8.25、17.36 mg L 1;表达产物TAC和2TAC对大肠杆菌K88和伤寒沙门氏菌都具有明显的抑菌作用,2TA C经BrCN水解产物抑菌活力高于TAC。

鲑鱼降钙素串联基因的克隆、表达及重组蛋白的生物学活性

目的 :将鲑鱼降钙素 (salmoncalcitonin,sCT)基因以同向串联方式连接 ,构建串联多拷贝基因的表达质粒pHis-nCT(n≤3) ,并在原核中表达 ,研究表达产物的降钙活性。方法 :采用半化学半酶促法合成sCT基因 ,利用基因的特点及特殊的酶切位点NdeI和SamI在表达载体pTrcHisC中进行sCT基因与载体基因的融合及sCT基因的串联 ,并在TOP10中表达串联多拷贝基因。表达产物形成包含体 ,对包含体变性、复性后 ,以Ni-ChelatingSepharose亲和纯化。用血清钙浓度测定法研究串联表达产物及裂解产物的降钙活性。结果 :重组菌表达的串联融合蛋白经过变性、复性及亲合层析 ,纯度达到 90 %以上。活性试验表明 ,串联融合蛋白及其裂解产物可以抑制破骨细胞 ,降低血清钙浓度 ,且呈剂量效应关系。结论 :原核表达质粒pTrcHisC可以有效表达串联的sCT基因 ,重组的串联蛋白及裂解产物均有降钙活性。

大豆异黄酮生物合成串联基因簇及其表达载体的构建

植物异黄酮是一种重要的次级代谢产物,在植物的生理活动以及人类健康方面具有重要作用。植物异黄酮生物合成途径有三个调控酶:查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS),查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)和异黄酮合酶(Isoflavone synthase,IFS)。以大豆为材料,利用RT-PCR方法克隆到查尔酮合酶基因(CHS),查尔酮异构酶基因(CHIⅡ)和异黄酮合酶基因(IFS)的cDNA(Genebank登记号分别为EU526827,EU526829,EU526830)经过NCBI在线Blast比对,相似度均在98%以上,确认克隆的目标基因是正确的;将这三种基因顺序连接,构建成串联基因簇CHS-CHIⅡ-IFS(命名为rIFS),并且构建了rIFS的原核表达载体,进行了初步的表达研究。为进一步研究植物异黄酮的生物合成以及进行异黄酮生物工程奠定了基础。

人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体的构建

目的构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达目的蛋白。方法合成人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位的串联基因,克隆入pET-28a(+)载体中,构建重组表达载体pET-28a-H3,经酶切鉴定和DNA序列分析后,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,并进行ELISA和Westernblot鉴定。结果重组载体pET-28a-H3酶切片段大小和DNA序列分析与预期结果一致。表达的目的蛋白相对分子质量约9400,与相应的多克隆抗体反应性良好。结论已成功构建人甲型流感病毒H3N2亚型中和表位串联基因原核表达载体pET-28a-H3,并表达了目的蛋白,为制备单克隆和多克隆抗体奠定了基础。

大黄鱼与美国红鱼抗菌肽Piscidin串联基因的构建、酵母表达及抗菌活性鉴定

采用Piscidin基因串联表达的方案,通过Eco 31Ⅰ限制性内切酶定向连接方法合成Pseudosciaena crocea-Sciaenops ocellatus-piscidin(PSP)串联基因.以毕赤酵母(Pichia pastoris)的穿梭表达载体pPICZαA构建重组表达质粒pPICZαA-PSP,转化入毕赤酵母SMD1168菌株中.应用实时荧光定量PCR方法进行多拷贝克隆筛选,实现了PSP重组串联肽的诱导表达和纯化,并对其抑菌活性进行初步鉴定,为piscidin抗菌肽的生产应用奠定基础.

大豆血红蛋白串联基因簇转化根瘤菌工程菌株的构建

研究提取大豆根瘤总RNA并将其反转录成cDNA,以其为模板采用同源序列克隆法,利用PCR技术获得大豆血红蛋白基因lbc3、lbc2、lbc1、lba的编码区序列;利用DNA重组技术,将4个血红蛋白基因顺序连接,构建成串联基因簇lbc3-lbc2-lbc1-lba(命名为lbX),并构建了lbX的原核表达载体pTR-Plac-lbX;采用三亲本杂交的方法,将原核表达载体pTR-Plac-lbX转化土著大豆根瘤菌,构建转基因根瘤菌工程菌株SFH(pTR-Plac-lbX),为研究转基因工程菌株对大豆根瘤固氮能力的影响奠定基础。

人工合成肺孢子菌p55抗原串联基因真核表达载体的构建及表达

目的研究肺孢子菌p55抗原人工合成串联基因的真核表达载体构建及其表达鉴定。方法从肺孢子菌p55蛋白5个变异体中选取可能在肺孢子菌肺炎中起重要作用抗原表位,串联合成一段多表位基因,命名为TAG。将TAG双酶切后克隆到pIRES-hrGFP-1a真核表达载体,构建重组质粒pIRES-hrGFP-1a/TAG,将重组质粒转染至感受态TG-1大肠杆菌中进行扩增后,经提取纯化质粒再转染至HEK293细胞,用Western blot鉴定蛋白表达水平。结果构建的pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒经酶切后测序鉴定,证明其序列正确,成功转染至HEK293细胞,Western blot检测其在HKE293细胞中能进行有效基因表达。结论本研究构建了pIRES-hrGFP-1a/TAG重组质粒,并在HEK293细胞中成功表达,为进一步阐明TAG的免疫保护功能以及核酸疫苗的研究奠定基础。

串联的人胸腺素α1基因在番茄中的高效表达

【目的】提高免疫活性多肽人胸腺素α1(Tα1)在番茄中的表达量。【方法】根据植物偏爱密码子对Tα1基因进行优化,并将其顺式串联成四联体,同时在单体基因间插入肠激酶剪切位点基因序列,以便表达的融合蛋白可以被肠激酶切割成单体。利用农杆菌介导法将单体Tα1基因和四联体Tα1基因分别转化进入番茄。【结果】两个基因转化番茄后分别得到卡那霉素抗性再生植株19株和10株,PCR和Southern杂交检测证明,部分番茄基因组中整合了外源基因。经过Western和ELISA分析,串联的Tα1基因已经在番茄果实中表达,表达量最高相当于20.2μg T α1·g-1果实鲜重,高于单体基因的表达量。【结论】基因串联的方式提高了Tα1基因在番茄中的表达量。

新孢子虫NcGRA7与NcGRA2串联基因的真核载体构建与体外瞬时表达

本研究为构建新孢子虫NcGRA7与NcGRA2串联基因的真核表达载体,以SOE-PCR技术得到新孢子虫NcGRA7-NcGRA2串联基因,并先克隆到pMD-19T载体上,经测序未发现移码后,再克隆到pDNA3.1载体上,用IFA进行体外瞬时表达的鉴定。结果表明,pDNA3.1-NcGRA7-NcGRA2串联基因的真核表达载体构建成功,在体外真核细胞内能表达外源蛋白。

伪狂犬病病毒gB蛋白抗原表位基因串联构建及原核表达

本试验通过自行设计两段引物,利用重叠延伸PCR方法,将伪狂犬病病毒(PRV)gB基因两段优势抗原表位序列串联,克隆至pMD18-T载体,测序正确后双酶切连接至pET-32a(+)载体,构建重组质粒;重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导后,通过SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白表达情况。经检测,诱导后的重组蛋白获得表达,重组蛋白大小约为54ku,其中串联蛋白大小约为34ku。该重组蛋白可与伪狂犬病病毒gB蛋白单克隆抗体发生特异性反应,表明重组蛋白的抗原性良好。

一种构建多拷贝串联小分子多肽基因的方法

目的:构建蛇毒锯鳞蝰血抑环肽(Ecs)基因串联多拷贝重组质粒。方法:采用重叠延伸PCR克隆Ecs基因,将第28位Met的密码子突变为Leu,利用其序列特点及酶切位点,在表达载体pET30a上将Ecs基因以同向串联方式连接,在E.coliBL21(DE3)中表达产物。结果:工程菌表达的串联Ecs与预期结果相符,实现了Ecs基因的串联表达。结论:为活性小肽的体外表达提供了新的思路和方法。

μ芋螺毒素基因的串联表达

芋螺毒素是一类小分子多肽,专性作用于生物系统的离子通道及其它神经递质。针对自然产芋螺毒素产量小、采集、提取困难等因素,采用基因表达的方法,将μ-芋螺毒素基因进行串联,在大肠杆菌中得到了有效地表达。

利用大肠杆菌tyrB-aspA基因串联表达制备L-苯丙氨酸

从大肠杆菌K12菌株中获得tyrB和aspA基因,将2个基因串联并克隆到pλPR质粒上,然后转化到E·coliP2392菌株进行表达。相应酶活力和氨基酸产量检测结果表明,单基因表达和双串联基因串联表达菌株的酶活性成倍提高,与原始菌株相比,AspA活力分别提高243%与239%,TyrB活力分别提高到247%和236%。以基因双串联表达菌株E·coliPBA的菌体悬浮液为酶原,以铵盐、反丁烯二酸和苯丙酮酸为酶转化底物,反应3h后,苯丙酮酸转化苯丙氨酸的效率为93%,苯丙氨酸产率达到0·6g/(g·h)(细胞),是对照菌株的4·7倍。

基因串联原核高效表达胸腺肽α1

人工合成含有SD序列、胸腺肽α1(Tα1)基因、纯化标签和酶切位点的DNA序列作为构建元件,利用同尾酶将其依次克隆到pET-32a(+)中,得到含有1～8个不同重复数目的含SD序列基因的串联表达载体,利用PCR初步鉴定和进一步的测序证实序列完全正确。进而利用lacZ基因作为指示基因,将带有SD序列的lacZ基因克隆到不同Tα1基因串数载体末尾,利用蓝白斑实验验证启动子后不同SD序列的效率,证实串联载体中的各个SD序列均能有效启动翻译。在此基础上对各串表达载体进行摇瓶发酵,SDS-PAGE电泳检测证实各串均可正确表达Tα1,且为可溶性表达,为小肽原核高效表达提出了新方法,有望成为小肽高效表达的新途径。

苯丙氨酸合成的关键酶基因aroG与pheA串联表达

ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ 是与苯丙氨酸合成有关的两个重要基因。在大肠杆菌（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ） 中，ａｒｏＧ 基因编码脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸合酶（ＤＳ） ，该酶催化由糖代谢中心途径分流出来的磷酸烯醇丙酮酸（ＰＥＰ） 和赤鲜糖４磷酸（Ｅ４Ｐ） 缩合形成脱氧阿拉伯糖型庚酮糖磷酸（ＤＡＨＰ） 的反应；ｐｈｅＡ 基因编码一个双功能酶蛋白，它同时催化两步关键反应，即具有分枝酸变位酶（ＣＭ） 和预苯酸脱水（ＰＤ） 的两种功能。采用ＰＣＲ 技术分别从两个不同品系的大肠杆菌染色体ＤＮＡ 中扩增到ａｒｏＧ 和ｐｈｅＡ。当这两个基因串联在一个质粒上导入大肠杆菌Ｐ２３９２ 中进行表达时，它们编码的酶ＤＳ、ＣＭ 和ＰＤ 活性分别提高４－３ 、４－４ 和２－２ 倍；导入短杆菌（ Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）２７３１ 中表达时，相应的酶活性分别提高１２－３ 、２－３ 和５－６ 倍。两基因的串联表达能大幅度地提高工程菌株的苯丙氨酸发酵产量。

江苏地区汉族人群六个短串联重复基因座的群体遗传学研究(英文)

采用复合扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳分型和银染显示的方法 ,对江苏地区汉族人群中 111个无关个体的 6个短串联重复 (STR)基因座 (CSF1PO ,TPOX ,TH0 1,D16S5 39,D7S82 0和D13S317)进行了群体遗传学研究。经X2 检验 ,6个基因座的基因型频率符合Hardy Weinberg平衡定律 (P >0 .0 5 )。它们的联合个体识别率 (DP)值 >0 .9999;联合非父排除率 (PE)值 >0 .9882。这 6个基因座在江苏地区汉族人群中显示了高度的多态性和良好的鉴别能力 。