人肽抗生素hPAB-β多拷贝串联基因工程菌的筛选及发酵研究

目的 :对已构建的人肽抗生素hPAB β 1～ 8拷贝串联基因工程菌进行筛选 ,并对其优势菌株进行发酵研究 ,为hPAB β的规模生产奠定基础。 方法 :对 1～ 8拷贝串联基因工程菌的目标蛋白表达率进行比较后 ,选择 2～ 5拷贝菌进行菌产量、目标蛋白表达率、包涵体溶解性、亲和层析效果比较 ,确定最佳多拷贝菌 ;对其摇瓶条件下发酵的培养液、温度、气体条件、IPTG诱导时机、浓度及时间进行研究。 结果 :在相同条件下 ,3拷贝菌产量(3.15 3g/L)最高 ,目标蛋白表达率 (2 7.8% )接近最高水平 ,包涵体能溶解完全 ;利用亲和层析能成功捕获融合蛋白 ,后者经羟胺裂解 ,可获得相对分子质量与合成hPAB β成熟肽大小相符的小肽 ,筛选出的优势菌传代稳定 ,其最佳摇瓶发酵条件为 37℃ ,16 0r/min条件下 ,在改良M 9 CAA培养液中培养至吸光值 (A60 0 )≈ 2 .5时 ,以终浓度为10 0 μmol/L的IPTG诱导表达 5h。 结论 :确定了 3拷贝菌为最佳多拷贝菌 ,并确定了其最佳摇瓶发酵参数。

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答

以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)～141-160(20AA)～21-40(20AA)～141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值.

含串联多拷贝DNA序列的质粒载体的构建

目的探索简便快速的构建含有串联多拷贝DNA序列的质粒载体的方法。方法通过PCR的方法获得不同拷贝数的DNA序列的片段,以与载体同源重组的方式将PCR片段与载体重组,得到重组质粒。最后经BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定来确定所构建质粒中插入重复DNA序列的拷贝数。结果经酶切鉴定分析,所得质粒分别可以切出不同大小的片段,而且片段大小与所插入的重复DNA序列拷贝数是相对应的。结论成功构建了含有串联多拷贝DNA序列的质粒载体,为向质粒载体中插入多拷贝DNA序列提供了简便实用的新方法。

头尾串联双拷贝HBVDNA重组体的构建

为构建含筛选基因并能在转染细胞内建立HBV复制状态的真核表达载体，利用BamHI与BglH粘端互补的特点，将经BamHI线性化的HBVDNA（adr亚型）克隆于表达新霉素基因的载体pcDNA3的BamHI与BglII位点间，获得含头尾串联双拷贝HBV基因组的重组质粒。

顺式串联双拷贝DuIFN—γ基因的真核表达

目的：以鸭γ－干扰素（DuIFN-γ)基因为目的基因，研究同一启动子调控下，不同拷贝数的目的基因的表达状况。方法：采用基因重组技术构建含DuIFN-γcDNA单拷贝和双拷贝重组质粒并转入真核细胞COS－7中进行表达。DuIFN-γ活性采用Griess试剂检测。结果：双拷贝重组质粒和单拷贝重组质粒50％最大活性稀释度分别为1：320和1：160。双拷贝重组质粒转染上清稀释10240倍后，仍保留DuIFN-γ活性，而单拷贝重组质粒转染上清经1280倍稀释后，即丧失活性。结论：在同一启动子作用下，顺式插入双拷贝目的基因可明显增强目的基因在真核细胞中的表达量。

一种多拷贝串联基因的链霉菌表达载体的构建方法

目的建立一种链霉菌外源基因多拷贝串联表达的载体构建方法。方法首先以链霉菌整合型载体p SET152为基础,构建表达载体p FIM001。该质粒携带链霉菌强启动子Perm E*,与下游外源基因组成表达盒;紧接着在载体p FIM001插入了tcs D基因构建质粒p FIM101,并且引入了XbaⅠ及SpeⅠ等位点;通过表达盒串联定向克隆法完成多拷贝tcs D的插入。结果成功构建外源多拷贝基因表达载体p FIM001,建立了表达盒串联定向克隆法,获得含不同拷贝tcs D基因的质粒。结论可以用这个方法构建多拷贝基因质粒。

不同拷贝数及间隔肽序列对毕赤酵母分泌表达EXA的影响

通过多拷贝串联表达，以及在分泌信号序列和目的蛋白N端之间插入几个氨基酸的间隔短肽，以提高exendin-4类似物串联体EXA在重组毕赤酵母中的分泌表达水平。实验结果表明：2～5个EXA串联插入均比单个EXA插入有利于提高表达水平，而4拷贝EXA串联体的表达产物较多滞留在胞内。在EXA的N端增加间隔肽可促进蛋白分泌，与不合间隔肽序列的4拷贝EXA串联表达载体相比，含有糖基化住点（NTTEEGEPK）和肠激酶识别位点（DDDDK）间隔肽的插入，使蛋白表达水平分别提高了4倍和9倍。

液相色谱-高分辨质谱结合蛋白质组学技术分析曲妥珠单抗耐药胃癌细胞的转录因子

采用基于液相色谱-高分辨质谱的转录因子结合序列串联多拷贝双联DNA结合元件(Concatenated tandem array of transcription factor response elements,catTFRE)Pull down蛋白质组学技术,研究了曲妥珠单抗耐药胃癌细胞的转录因子及其调控作用。以合成的串联转录因子结合序列DNA片段为亲和试剂,用生物素标记,作为"DNA诱饵",通过Pull down富集后,采用液相色谱-高分辨质谱检测捕获的转录因子,基于强度定量法(Intensity based absolute quantification,iBAQ)定量,筛选出与DNA结合活性显著变化的转录因子。利用WebGestalt(2017)数据库对激活转录因子调控的信号通路、家族分类、调控网络及转录因子-靶基因(TFs-targets)进行分析。结果表明,359个转录因子被定量检测,与亲本细胞相比,61个转录因子在曲妥珠单抗耐药胃癌细胞中与DNA结合活性显著变化,其中结合活性增强48个,活性降低13个。激活转录因子属于bZIP、bHLH、homebox、HMG box、Zine finger等家族。KEGG通路富集显示,癌症、MAPK、Wnt、TGF-β、凋亡等多条通路在耐药细胞中显著改变。TFs-targets分析表明,TCF7L2、TCF7、FOXC1、JUN、CYC、FOS、ELK4、NFκB2、DDIT3和ATF2在上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transformation,EMT)、Wnt、MAPK信号通路促使胃癌曲妥珠单抗耐药过程中发挥重要调控作用,提示靶向这些转录因子所调控的信号通路可能是逆转胃癌曲妥珠单抗耐药的重要途径。

多拷贝GnRH类似物的原核表达及其纯化

目的原核表达促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone,Gn RH)类似物,并进行纯化。方法人工合成8拷贝Gn RH类似物基因,并利用同尾酶技术构建16拷贝的Gn RH类似物基因,将8和16拷贝串联的Gn RH类似物基因分别克隆至p GEX-2t原核表达载体上,构建Gn RH类似物基因多拷贝串联表达的重组质粒,并转化大肠埃希菌BL21,利用优化后的IPTG诱导表达条件表达的重组Gn RH类似物蛋白经Glutathione Sepharose 4B柱纯化并酶解后,进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果质粒p GEX-2t-8Gn RH analogue和p GEX-2t-16Gn RH analogue经双酶切及测序证明构建正确。当IPTG终浓度为0.2 mmol/L,37℃诱导2 h时,破菌后上清中目的蛋白表达量最高。表达的重组蛋白相对分子质量约37 000,可与兔抗Gn RH单克隆抗体特异性结合,纯化后的重组蛋白相对分子质量约1 400,蛋白浓度约260μg/ml。结论已成功构建Gn RH类似物多拷贝基因重组质粒,并在大肠埃希菌中高效表达,为多拷贝法生产生物活性小肽Gn RH类似物奠定了基础。