基于串联质谱标签的蛋白质组学联合高内涵筛选技术筛选胃癌相关基因的研究

目的:应用Tandem mass tag(TMT)技术联合高内涵筛选(HCS)寻找潜在的胃癌相关基因。方法:利用TMT技术从胃癌及癌旁组织中筛选差异表达蛋白质,应用GO和KEGG数据库进行注释和信号通路富集并结合PubMed数据库结果,筛选出胃癌中未见或较少报道的上调目的基因。通过shRNA技术敲减基因,HCS技术比较敲减对细胞增殖的影响,筛选出肿瘤增殖相关基因并通过检测mRNA含量、克隆形成和CCK8进行验证。结果:通过TMT从胃癌和癌旁组织定量到差异表达蛋白1008个(上调649个,下调359个),25个目的基因敲减后HCS结果显示SF3B4敲减抑制细胞增殖,验证发现SF3B4是潜在的胃癌细胞增殖相关基因。结论:TMT技术结合HCS为肿瘤相关基因的筛选提供新的可能性。本研究提示SF3B4是潜在的胃癌增殖相关基因,为研究胃癌发生机制提供新线索。

基于串联质谱标签的蛋白质组学技术分析海水流化冰辅助保鲜对大黄鱼肌肉蛋白质的影响

为研究大黄鱼(Larimichthys crocea)蛋白质在海水流化冰辅助保鲜期内的变化,采用串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)技术定量标记新鲜(贮藏0 d)大黄鱼及不同海水流化冰贮藏时间(7、23 d)下大黄鱼的肌肉蛋白质,筛选出不同贮藏时间下的差异表达蛋白,并对差异蛋白进行基因本体(gene ontology,GO)、直系同源簇/真核生物直系同源簇(clusters of orthologous groups/clusters of eukaryotic orthologous groups,COG/KOG)与京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析。结果显示,在3个比较组(7 d vs 0 d、23 d vs 7 d和23 d vs 0 d)中鉴定到的差异蛋白总数分别为215、133、269个,其中表达上调的差异蛋白数分别为117、37、113个,表达下调的差异蛋白数分别为98、96、156个。同时,3个比较组的共有差异蛋白为44个。GO分析表明,差异蛋白主要参与细胞过程、生物调节、细胞和细胞内组分、结合功能和催化活性等方面;COG/KOG分析表明,差异蛋白的功能活性主要集中在细胞骨架、碳水化合物转运和代谢、信号转导机制以及翻译后修饰、蛋白质周转和伴侣蛋白等方面;KEGG分析表明,差异蛋白共参与38条信号通路,且在贮藏后期(23 d),紧密连接和致病性大肠埃希菌感染2条信号通路中差异蛋白的参与数目最多,它们可能是造成大黄鱼新鲜度急剧下降的主要信号通路。44个共有差异蛋白与大黄鱼新鲜度指标进行的相关性分析表明,脆性X智力低下综合征相关蛋白2、肌醇-1-单磷酸酶、Rho GDP解离抑制剂1、锚蛋白-1和甲基四氢叶酸合酶结构域蛋白可以作为新鲜度指示蛋白。本研究为揭示大黄鱼在海水流化冰贮藏期内的品质变化机制、大黄鱼新鲜度评价和保鲜工艺改进提供了依据。

基于串联质量标签定量质谱法的胶质瘤外泌体蛋白组差异分析

为筛选胶质瘤外泌体中参与肿瘤迁移的差异蛋白,寻找可能抑制肿瘤细胞迁移的作用靶点.本试验分别对具有不同迁移能力的A172、U251胶质瘤细胞系培养上清液进行了差异性探究.结果显示,A172条件培养基具有更强的迁移促进作用,而外泌体为促进肿瘤迁移的主要成分.随后利用串联质量标签(tandem mass tag,TMT)定量质谱法对其外泌体进行的蛋白质组学分析发现,差异蛋白(倍数改变≥2)主要富集于核糖体、间隙连接、泛素介导的蛋白降解三个KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)信号通路.通过分析共获得了50种具有显著表达差异的外泌体蛋白,可作为胶质瘤的外泌体检测标志物及抑制肿瘤细胞迁移的潜在作用靶点.

用于相对和绝对定量的等量异位标签-二维液相色谱-串联质谱法分析雌二醇和血清剥夺对乳腺癌细胞内蛋白质含量的影响

雌激素和血清中的激素及各种生长因子在乳腺癌的发生、发展过程中发挥着重要的作用。研究雌激素和血清对乳腺癌细胞中蛋白质组成和含量的影响对于阐明雌激素和血清对乳腺癌细胞影响的分子机理具有重要的意义。利用四重用于相对和绝对定量的等量异位标签(isobaric tags for relative and absolute quantification,iTRAQ)标记结合二维液相色谱-串联质谱(two-dimensional liquid chrom atography-tandem mass spectrometry,2D-LC-MS/MS)对雌二醇(17β-oestradiol,E2)和血清各自以及共同作用对MCF7乳腺癌细胞内蛋白质表达的影响进行了比较,共鉴定到置信度在95%以上的蛋白质576种,其中各组相对于正常培养组的细胞共找到26种差异在1倍以上的蛋白质,其中10种上调,16种下调。研究发现E2和血清可显著影响细胞内与蛋白质合成相关的蛋白质的水平。实验结果表明:iTRAQ-LC-MS/MS是进行多个样品差异蛋白组比较的一种有效方法。

肌萎缩侧索硬化患者的脑脊液存在差异表达蛋白:基于串联质谱标签方法

目的基于串联质谱标签(TMT)技术,从蛋白质组学层面研究肌萎缩侧索硬化(ALS)患者脑脊液(CSF)中的差异性表达蛋白,探讨ALS发病的机制和相关作用途径。方法选取2017年11月～2018年4月于中国人民解放军联勤保障部队第928医院和中南大学湘雅医院神经内科就诊5例延髓起病ALS患者和5例肢体起病ALS患者,以5例偏头痛及低颅压头痛的患者为健康对照,分别获取CSF,利用串联质谱标签(TMT)技术鉴定CSF中差异性蛋白质,并进行生物信息学分析。结果共鉴定并定量1530种蛋白。延髓起病ALS患者中48种蛋白表达上调,6种蛋白表达下调;肢体起病ALS患者中16种蛋白表达上调,19种蛋白表达下调。GO分析显示这些蛋白均参与细胞生理过程、单器官过程和生物调节等过程,在细胞内和细胞外均有分布,且具有结合功能、催化活性和受体活性等。KEGG通路分析显示,延髓起病ALS患者CSF中上调蛋白参与溶酶体和代谢等3条通路。肢体起病ALS患者CSF中下调蛋白参与补体和凝血级联途径、金黄色葡萄球菌感染和单纯疱疹感染等7条通路,各通路均包含补体成分。结论延髓起病和肢体起病的ALS患者CSF中均存在差异性表达蛋白。溶酶体通路参与延髓起病ALS的发生和发展,免疫反应参与肢体起病ALS的发生和发展。

基于串联质谱标签定量蛋白质组学技术的芍甘附子汤治疗类风湿关节炎作用机制研究

目的采用串联质谱标签(TMT)定量蛋白质组学技术探讨芍甘附子汤治疗类风湿关节炎(RA)的作用机制。方法建立牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎(CIA)大鼠模型,将造模成功的大鼠分为模型组和芍甘附子汤组(2.1 g·kg^(-1)),并设置正常组,每组16只。首次免疫3周后,芍甘附子汤组予芍甘附子汤2.1 g·kg^(-1)灌胃,模型组和正常组予等量生理盐水,每日1次,连续28 d。于首次免疫前(d 0)及免疫后d 7、d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49测定足跖体积并计算肿胀度,于d 14、d 21、d 28、d 35、d 42、d 49进行关节炎指数(AI)评分。末次给药24 h后,麻醉大鼠,取膝关节滑膜组织,采用TMT蛋白质组学技术筛选各组间滑膜组织差异蛋白质,基因本体论(GO)对差异蛋白质进行功能注释,京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库对差异蛋白质所涉及的信号通路进行分析。结果与正常组相比,模型组大鼠足跖出现明显肿胀(P<0.05,P<0.01);与模型组相比,芍甘附子汤组大鼠足跖肿胀度和AI明显下降(P<0.05,P<0.01)。与正常组比较,模型组鉴定出白细胞介素1受体辅助蛋白b(IL1RAP)、神经细胞黏附分子-接触蛋白-1(Cntn1)、衣被蛋白复合物ζ亚基(Copz1)等85个差异表达蛋白;与模型组相比,芍甘附子汤组鉴定出IL1RAP、组织蛋白酶L1(Ctsl)、1-酰基甘油-3-磷酸O-酰基转移酶ABHD5(ABHD5)等49个差异表达蛋白;GO富集分析表明差异蛋白质主要涉及催化、结合活性等45个分子功能(MF),脂质代谢、信号传递等104个生物学过程(BP),细胞膜、细胞器和大分子复合物等23个细胞组分(CC);KEGG分析表明差异蛋白质主要涉及TGF-β信号通路、Apelin信号通路等18条信号通路。结论芍甘附子汤对CIA大鼠滑膜的49个蛋白具有调节作用,其治疗RA的机制可能主要与下调IL1RAP、Ctsl,上调ABHD5表达有关。

丹酚酸A对缺血性脑卒中模型大鼠海马区蛋白影响的串联质谱标签蛋白组学分析

背景:丹酚酸A对缺血性脑卒中后缺血侧海马区蛋白表达的影响及其作用机制尚未明确。目的:观察丹酚酸A对缺血性脑卒中大鼠海马区蛋白差异表达的影响,探讨其可能的神经保护机制。方法:采用改良Longa方法制备缺血性脑卒中大鼠模型,造模后随机分为生理盐水组与丹酚酸A组(n=6)。丹酚酸A组于线栓拔出后尾静脉注射2 mg/kg丹酚酸A;生理盐水组注射等体积的生理盐水。采用改良神经功能缺损评分标准评价大鼠神经功能;T2加权成像检测脑梗死体积;旷场实验及Morris水迷宫测试观察各组大鼠的自主行为、学习记忆能力;串联质谱标签定量蛋白组学技术分析缺血性脑卒中模型大鼠缺血侧海马区蛋白的差异表达。结果与结论:①与生理盐水组相比,丹酚酸A组大鼠改良神经功能缺损评分显著降低;②T2加权成像显示,丹酚酸A组较生理盐水组脑梗死体积明显减少;③旷场实验结果发现,丹酚酸A组大鼠自主活动及自由探索行为表现更佳;④Morris水迷宫测试结果表明,丹酚酸A组大鼠在定向航行实验中逃避潜伏期明显缩短、穿越平台次数相较于生理盐水组显著增加;⑤缺血侧海马区差异蛋白质分析结果发现,丹酚酸A组与生理盐水组之间筛选出50个上调及3个下调差异蛋白;基因本体论分析表明它们主要参与binding,catalytic activity等分子功能;京都基因和基因组百科全书信号通路分析显示,它们主要涉及Complement and coagulation cascades,Staphylococus aureus infection等信号通路;⑥结果显示,丹酚酸A可能通过调控缺血性脑卒中大鼠缺血侧海马区差异蛋白、补体及凝血级联信号通路,对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。

基于TMT技术的激素性股骨头坏死硬化带修复模式探索及临床验证

背景:股骨头内硬化带是激素性股骨头坏死疾病发展过程中重要的影像学特征并与预后相关。过氧化物酶体增殖物活化受体γ协同刺激因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)被证明具有成骨、促血管形成、抗线粒体凋亡等生物活性,与激素性股骨头坏死的骨修复可能存在紧密关联。目的:筛选激素性股骨头坏死硬化带区与正常区的差异蛋白,筛选出硬化带的关键蛋白,并验证关键蛋白在激素性股骨头坏死股骨头标本中的差异表达;探索激素性股骨头坏死硬化带修复模式。方法:取激素性股骨头坏死行人工全髋关节置换术取出的股骨头标本,通过串联质谱标签技术筛选硬化带区与正常区的差异表达基因,并进行GO与KEGG信号通路分析,构建关键靶点的蛋白互作网络、筛选关键基因。观察关键蛋白在激素性股骨头坏死硬化带中的表达,通过Western blotting、免疫组化验证关键蛋白在硬化带中的表达。结果与结论:①通过串联质谱标签定量蛋白质谱检测发现:相比于正常区骨组织,股骨头硬化带骨组织中具有显著差异表达(Log_(2)FC>1.20、Log_(2)FC<0.84和P<0.05)的蛋白质有609个,其中发生上调的蛋白质290个,发生下调的蛋白质319个;②通过GO与KEGG通路富集分析,发现在前10位的富集通路中,Wnt信号通路与生命周期调控通路与骨修复关系密切;在生命周期调控通道中,PGC-1α是重要的蛋白之一;③与激素性股骨头坏死标本正常区相比,Western blotting验证了PGC-1α、NRF-1在硬化带中低表达,Cleaved Caspase-3在硬化带中高表达;④光镜下免疫组化结果显示,股骨头组织标本中硬化区及正常区的PGC-1α、NRF1及Cleaved Caspase-3阳性染色分布,可以发现骨小梁、成骨细胞和骨髓均有表达存在;硬化带区Cleaved Caspase-3表达更为明显;⑤结论:激素性股骨头坏死硬化带中存在包含Wnt等成骨相关通路活跃、以PGC-1α低表达为特征的氧化凋亡活跃等生物学行为;PGC-1α在激素性股骨头坏死硬化带中低表达可能与氧化凋亡活跃相关。

应用TMT结合质谱技术筛选高原红细胞增多症患者血浆差异表达蛋白

目的:应用串联质谱标签(TMT)结合质谱技术比较高原红细胞增多症(HAPC)患者和健康对照者血浆中的差异表达蛋白。方法:收集HAPC患者血浆4例,与之相匹配的健康对照组血浆5例,组内等量混合后利用多重免疫亲和层析柱去除14种高丰度蛋白,TMT试剂标记后样本进行液相色谱分离,采用HPLC-MS/MS质谱鉴定及相对定量;获取HAPC患者和健康对照血浆各20例,ELISA方法验证部分筛选的差异蛋白。结果:共鉴定和定量了1 094种蛋白,差异表达的蛋白有249种,其中HAPC组较健康对照组表达量≥1.5倍的上调蛋白质有162种,表达量≤67%的下调蛋白质有87种;C反应蛋白和血清淀粉样蛋白A在HAPC组中较健康对照组表达量均上调(P<0.05)。结论:筛选出多种与炎症相关的差异表达蛋白,为深入研究HAPC发生机制奠定了良好基础。

基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱与电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱分析蛋白质

为比较基质辅助激光解析电离-串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)和电喷雾离子化-四极杆-飞行时间质谱(ESI-Q-TOF)在蛋白质定性和定量分析方面的性能,分别利用两种仪器对用于相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)标记的雌激素刺激前后MCF7细胞内的蛋白质水解产生的多肽进行了定性和定量分析。结果表明,用MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别鉴定出1086种和848种蛋白质,其中相同的蛋白质为633种;MALDI-TOF-TOF和ESI-Q-TOF方法分别找到38种和33种表达差异在0.5倍以上的蛋白质,其中3种为相同的蛋白质。实验数据说明,两种仪器在蛋白质定性和定量分析方面有很大的互补性,将两种仪器结合使用,不仅能够显著提高蛋白质定性和定量分析的覆盖率,而且可提高分析的置信度。

基于TMT和PRM技术筛选车叶草苷干预CUMS大鼠海马组织的差异表达蛋白

【目的】基于蛋白质组学探讨车叶草苷对慢性温和应激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型大鼠海马组织的保护作用机制,为车叶草苷的开发利用提供依据。【方法】选取45只雄性SD大鼠预饲1周后,随机分为3组:空白组、模型组、车叶草苷组,每组各15只;空白组每笼饲养3只,其他组单笼饲养。试验周期为5周,于试验第3周开始,温和不可预知性刺激同时给药,车叶草苷组按0.070 g/kg BW剂量灌胃给药,空白组、模型组灌服等体积的生理盐水,每天一次。造模完成后提取大鼠海马组织总蛋白,利用同位素串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量标记技术进行抑郁模型大鼠海马蛋白质组学分析,筛选潜在差异表达蛋白,借助平行反应监测(parallel reaction monitoring,PRM)技术对候选蛋白在海马组织中的表达情况进行靶向验证。【结果】筛选出车叶草苷组、模型组之间6个上调和17个下调的差异表达蛋白;GO功能和KEGG通路富集分析表明,它们主要参与神经活性配体-受体相互作用、互补和协同调节级联、胃酸分泌等信号通路;PRM成功验证缓激肽(BK)、免疫球蛋白(IGHM及ILD)、蛋白酶体激活剂复合物亚基1(PSME1)4个蛋白表达趋势与TMT定量结果一致,可能是车叶草苷调节抑郁的潜在靶标蛋白。车叶草苷通过参与调控神经活性配体-受体相互作用等信号通路的关键靶标、下调BK蛋白表达对神经元发挥直接或间接的保护作用、上调与免疫球蛋白IgG表达显著相关的PSME1蛋白水平产生免疫抑制、使免疫蛋白浓度趋于正常等途径保护海马组织。【结论】车叶草苷可能通过多途径协同作用减轻机体抑郁症状。本研究结果为深入探索CUMS模型病理机制及阐明车叶草苷调控海马组织的蛋白质或通路提供参考。

肉芽肿性乳腺炎病灶组织差异表达蛋白质筛选及关键分子验证

目的分析肉芽肿性小叶性乳腺炎(GLM)病灶组织中的差异表达蛋白质,筛选GLM的生物标志物,再根据结果对关键分子进行验证。方法采用TMT标记定量蛋白质组学方法,对GLM患者(3例)病灶与正常乳腺组织中蛋白质组进行鉴定和定量,筛选出发生显著变化的差异表达蛋白质,导入Proteome Discoverer软件中,搜索Uniprot数据库,完成生物信息学分析。采用细胞因子抗体芯片技术对筛选出的关键分子进行定量和验证。结果GLM病灶组织与正常乳腺组织筛选出差异表达蛋白质1405个,其中1106个表达上调,299个表达下调。GO富集分析显示,这些差异表达蛋白质主要参与细胞过程、代谢过程、蛋白质代谢、生物学调节等。KEGG通路分析发现,差异表达蛋白质参与补体活化、免疫调节、炎症反应等。细胞因子定量分析验证了GLM病灶组织中IL-1β、MCP2、IL-6表达升高。结论GLM病灶和正常乳腺组织中存在差异表达的蛋白质参与炎症、免疫等多种信号通路,可能是GLM发生发展的关键分子。特定蛋白质是值得进一步研究的生物标志物。

发育性颈椎管狭窄人群血清差异蛋白质组学分析

背景:正常健康人与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清特异性生物学标志物尚未完全明确。目的:寻找并鉴定气虚血瘀证发育性颈椎管狭窄的潜在生物学标志物。方法:分别采集发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群血清9例、健康正常人群血清8例,采用同位素相对标记与绝对定量技术串联质谱标签联合液相色谱-串联质谱筛选2组人群血清的差异蛋白及鉴定,使用Western Blot法对肌球蛋白轻链3(MYL3)差异蛋白进行验证。结果与结论:(1)串联质谱标签技术:共鉴定出61个差异蛋白(P <0.05),其中与健康正常人群组比,补体成分C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18等14种差异蛋白明显上调,而肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等47种差异蛋白明显下调;(2)基因富集分析:这些差异蛋白可能参与染色体组织、线粒体膜组织、肌肉系统过程的调节等分子功能;(3)蛋白相互作用网络分析:健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的共同差异蛋白中补体C1q受体、载脂蛋白A4、C-C基序趋化因子配体18、肌球蛋白轻链3、线粒体翻译延伸因子、核仁磷酸蛋白1等38种位于功能网络节点,且与颈椎骨能量代谢、骨细胞产生、破骨细胞的形成等系统关系密切;(4)运用Western Blot法对主要差异蛋白肌球蛋白轻链3进行验证:其验证结果与蛋白组学结果相一致;(5)结论:通过绝对定量技术联合液相色谱-串联质谱技术发现健康正常人群与发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群之间的血清差异表达蛋白,并初步推测肌球蛋白轻链3可能是发育性颈椎管狭窄(气虚血瘀证)人群的特异性血清标志物。

静脉注射利多卡因后差异蛋白质的蛋白质组学分析

目的利用蛋白质组学技术定量分析静脉注射利多卡因(IVL)前后血清中差异蛋白质的表达。方法选取健康志愿者5例,IVL 1.5 mg·kg^(-1)后再以3 mg·(kg·h)^(-1)持续泵注30 min。IVL前和IVL后1 h各采集静脉血5 mL,通过串联质谱标记及高效液相色谱分离技术鉴定IVL后差异表达蛋白,并采用京都基因和基因组百科全书(KEGG)和基因本体论(GO)数据库分析鉴定差异蛋白的生物学信息。结果检测到IVL前后的血清中差异蛋白共15种,其中上调蛋白6种、下调蛋白9种。GO分析发现,大部分差异蛋白参与了细胞进程;亚细胞结构定位发现多数差异蛋白定位于细胞外区域及细胞质;功能富集分析发现多数蛋白参与炎性反应调节、B细胞的活化调控和蛋白质加工。上调蛋白组KEGG通路富集到p53信号通路。通过对上调组和下调组差异蛋白分析,发现差异蛋白依托泊苷诱导的2.4号蛋白(EI24)参与p53信号通路且调控钙离子浓度。结论IVL可能通过调控依托泊苷诱导的EI24和上池蛋白(SBSN)抑制肿瘤细胞的发生与发展;EI24可能通过调控细胞内钙离子浓度参与IVL产生的镇静作用。

TMT定量蛋白组学方法筛选乳腺癌腋窝淋巴结转移患者血清差异蛋白

目的:分析有腋窝淋巴结转移和无腋窝淋巴结转移的乳腺浸润性导管癌患者血清中的差异蛋白,筛选与乳腺癌转移相关的生物标志物和治疗靶点。方法:本研究采用定量蛋白质组学串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)标记技术分别对14例有腋窝淋巴结转移及14例无腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者血清蛋白进行检测,并对蛋白质进行定量分析,筛选出发生显著变化的差异蛋白,再搜索Uniprot数据库和用Proteome Discoverer软件分析,进一步进行生物信息学分析。结果:有腋窝淋巴结转移组中共筛选出差异蛋白119个,其中6个表达上调,113个表达下调。基因本体(gene ontology,GO)注释分析和功能聚类分析表明,这些差异蛋白质主要定位于细胞外区,与肿瘤的生物合成、细胞增殖、血管生成相关。Western boltting和qRT-PCR验证了K1C19(下调0.11倍)和PSME2(上调2.02倍)的表达。结论:TMT定量蛋白组学方法能有效筛选有腋窝淋巴结转移的和无腋窝淋巴结转移的乳腺癌患者血清中的差异蛋白。其中,K1C19和PSME2是值得进一步研究的乳腺癌淋巴结转移的候选血清标志物。

磺化修饰结合离子交换色谱和生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段

通过在肽段的N端引入磺酸基,从而使含组氨酸的肽段与其他肽段在pH<3.0的条件下产生电荷差异,建立了一种基于强阳离子交换色谱(SCX)结合生物质谱富集鉴定含组氨酸肽段的方法,并以含有组氨酸的标准蛋白质为模型,进行了方法学考察。结果表明,经N端磺酸化后,含组氨酸的肽段能有效地被阳离子交换色谱富集,且在肽的N端引入磺酸基促进了肽的裂解,使之产生简单而信息丰富的二级质谱图,从而得到完美的质谱鉴定结果。这说明磺化修饰结合强阳离子交换色谱用于含组氨酸肽段的富集鉴定是可行的,且具有在蛋白质组研究中应用的潜力。

亲和标记-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱用于蛋白质相对定量方法的研究

将亲和标记技术和基质辅助激光解吸电离飞行时间串联质谱联用,建立了蛋白质相对定量方法,以牛血清白蛋白为实验对象,考察了该方法的准确度、重现性等指标;又以数种标准蛋白混合物为研究对象,考察了该方法的动态范围及相应的标准偏差,为实际生物样品中差异蛋白质分析奠定了基础。

基于TMT定量蛋白质组学对白蛋白结合型紫杉醇所致周围神经病变的机制研究

目的基于串联质谱标签(tandem mass tag,TMT)定量蛋白质组学技术探究白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel,nab-PTX)导致周围神经病变的作用机制。方法将6只雄性成年SD大鼠随机分为实验组与对照组,实验组大鼠分别于第1,3,5,7天腹腔注射白蛋白结合型紫杉醇(10 mg/kg体质量),建立周围神经病变大鼠模型,对照组大鼠不进行特殊干预继续正常培养,期间观察两组大鼠状态、饮食及粪便情况,并隔日称量体质量。末次给药48 h后取L_(4-6)脊髓提取蛋白酶切后TMT标记。通过MaxQuant软件对TMT标记蛋白质进行鉴定及分析得出实验组与对照组的差异蛋白,对差异蛋白进行基因本体分析(gene ontology,GO)及京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果蛋白质组学共鉴定蛋白5519种,对4730种蛋白进行定量分析,筛选出370种差异蛋白,如组蛋白H2B(histone H2B)、载脂蛋白D(apolipoprotein D)、激肽原-1(kininogen-1)和载脂蛋白E(apolipoprotein E)等。实验组与对照组相比,差异蛋白富集于细胞胞内,主要参与细胞过程、生物调节及刺激反应等生物过程,多数具有结合、催化活性等分子功能。KEGG通路富集分析显示差异蛋白主要富集于哮喘(asthma)、类固醇生物合成(steroid biosynthesis)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、Notch信号通路(Notch signaling pathway)等通路。结论激肽原1(KNG1)、载脂蛋白E(ApoE)、丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)等可能是nab-PTX作用的重要靶点,nab-PTX可能通过鞘脂代谢、Notch信号通路及叶酸生物合成等通路引起周围神经病变。

基于TMT和PRM技术的湿性年龄相关性黄斑变性泪液蛋白质组学研究

目的研究未经诊治湿性年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration, AMD)患者的泪液蛋白质组学,绘制蛋白质图谱,筛选差异表达蛋白以鉴定潜在的生物标志物。方法以2017年7月至2018年3月于重庆医科大学附属第二医院眼科门诊就诊的33例未经诊治湿性AMD(nAMD)患者和同时期及地点的30例排除眼底疾病的正常老年人泪液为对象,采用串联质谱标签法(tandem mass tag, TMT)对鉴定两组样本的差异表达蛋白进行定量,对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析,并筛选出有潜在研究前景的候选蛋白,并使用平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)技术靶向验证候选蛋白在人群泪液nAMD中的表达情况。结果通过TMT相对定量蛋白质组学从未经诊治的湿性AMD患者和正常老年人的泪液中共定量到3 473个蛋白质,其中包含差异表达蛋白382个(122种蛋白上调,260种蛋白下调,P<0.05),通过GO功能富集分析和KEGG通路富集分析发现这些差异表达蛋白主要参与免疫反应和氧化应激的调节。选择MAOA、Transaldolase和LAMP-2作为潜在的生物标记物,并通过PRM成功验证到这3个候选蛋白的表达情况与TMT定量蛋白质组结果一致。结论采用TMT相对定量结合PRM靶向验证技术能有效地筛选出湿性AMD与正常人泪液中的382个差异蛋白,并验证提供3种潜在的生物标记物。

基于TMT蛋白组学技术探讨氯化汞致小鼠肝脏损伤的机制

目的利用蛋白组学技术筛选并鉴定氯化汞染毒后小鼠肝脏差异表达蛋白,为氯化汞的肝毒性作用机制研究提供线索。方法45只6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为5组:正常对照组,不同剂量氯化汞处理组,即低剂量组(1 mg/kg)、中低剂量组(4 mg/kg)、中高剂量组(8 mg/kg)、高剂量组(16 mg/kg)。氯化汞处理组每天灌胃给予不同剂量氯化汞,对照组给予等体积水,监测小鼠体重变化。第28天灌胃后处死小鼠,收集血清和肝脏组织,测定其血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)、肝脏谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining,HE)染色观察肝脏病理学变化;采用串联质谱标签(tandem mass tags,TMT)定量蛋白组学技术鉴定对照组与氯化汞高剂量组肝脏的差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs),并对其进行GO富集、KEGG通路富集分析。结果与对照组相比,中高剂量组与高剂量组小鼠体重降低(均P<0.05)、血清ALT活性显著增高、肝脏GSH-Px、CAT水平下降。HE染色结果显示氯化汞染毒可引起多种类型的肝细胞损伤。蛋白组学结果显示,与对照组相比,氯化汞高剂量组小鼠肝脏差异表达蛋白共有195个,其中上调99个、下调96个;GO富集分析显示氯化汞参与小鼠肝脏的糖代谢负调控、天冬氨酸家族氨基酸代谢等生物学过程;KEGG通路富集分析显示,氯化汞染毒可通过影响CYP450介导的外源化合物代谢、类固醇激素代谢、花生四烯酸代谢、胆汁分泌等信号通路产生肝脏毒性。结论氯化汞染毒严重影响小鼠肝脏多种蛋白的表达,导致相关代谢通路紊乱。