油茶乙酰CoA酰基转移酶基因cDNA克隆及序列特征分析

在已知油茶乙酰COA酰基转移酶基因EST序列基础上,设计6条特异引物,以油茶优良无性系‘湘林1号’种仁总RNA为模板,通过反应体系和反应条件优化,最终扩增出一条700 bp左右的目的片段,将该片段回收、克隆、测序,获得718 bp的cDNA序列,将该序列与油茶乙酰COA酰基转移酶基因进行序列拼接,确定了油茶乙酰COA酰基转移酶基因的全长cDNA序列,将该序列提交至GeneBank,登录号为GU594059。油茶乙酰COA酰基转移酶基因全长cDNA序列为1 495 bp,含有一个1 227 bp的ORF,编码408个氨基酸残基。在氨基酸序列水平上,该基因与胡黄连(P.kurrooa)的乙酰COA酰基转移酶基因的相似性最高,为86%,与稻瘟病菌(M.grisea)的最低,为65%。通过在线预测,油茶乙酰COA酰基转移酶基因编码蛋白的等电点pI为6.19,分子量Mw为41 628.6 Da。本研究为揭示油茶油脂合成规律和油茶的分子育种提供了理论依据和科学基础。

滇龙胆乙酰CoA转移酶基因的克隆与表达分析

根据滇龙胆转录组乙酰CoA酰基转移酶基因GrAACT序列设计引物,使用逆转录PCR(RT-PCR)技术从滇龙胆幼叶扩增该基因,并进行序列分析、原核表达和组织特异性分析。结果表明:GrAACT基因(登录号KJ917163)开放阅读框长1 215 bp,编码404个氨基酸;GrAACT蛋白相对分子质量41.41 ku,p I值为6.25,属于AACT蛋白家族成员,无信号肽,为疏水稳定蛋白,主要由α-螺旋、无规则卷曲构成;GrAACT蛋白具有AACT蛋白保守结构域:硫解酶N端结构域(第12~272位氨基酸)、硫解酶C端结构域(第282~402位氨基酸)、类硫解酶结构域(第13~403位氨基酸);在硫解酶C端结构域中,包含硫解酶保守位点(第350~366位氨基酸)、硫解酶活性位点(第385~398位氨基酸);滇龙胆GrAACT蛋白与长春花CrAACT蛋白亲缘关系最近;GrAACT基因在大肠杆菌中表达的重组蛋白相对分子质量约为67.41 ku;组织特异性表达分析结果表明,GrAACT基因主要在茎、根中表达。

茅苍术乙酰辅酶A酰基转移酶基因(AlAACT)的克隆与序列分析

目的:对茅苍术乙酰辅酶A酰基转移酶基因(AlAACT)全长进行克隆,并分析其序列特征,为后期解析茅苍术萜类次生代谢产物的生物合成机制提供实验依据。方法:根据转录组测序所得的AACT基因片段设计引物,利用逆转录PCR技术获得全长cDNA序列,并采用生物信息学手段分析其序列特征。结果:克隆获得AlAACT基因的全长cDNA序列为1227 bp,编码408个氨基酸,理论相对分子质量为41.98 kDa,等电点为5.82,不存在跨膜区以及信号肽,为亲水性蛋白,具有多个磷酸化位点。进化树分析发现AlAACT基因与其他植物AACT基因具有较高相似性,尤其是菊科蓟属植物洋蓟,表明该基因保守性高。结论:成功获得茅苍术AlAACT基因序列,并掌握其序列特征,为后续深入研究该序列在茅苍术萜类化合物合成途径中的功能提供了必要的实验基础和理论依据。

丹参乙酰CoA酰基转移酶基因全长克隆和SNP分析

乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)为萜类化合物生物合成甲羟戊酸(MVA)途径的起始酶,催化使2个分子的乙酰CoA缩合为乙酰乙酰CoA。利用基因芯片结合RACE方法,从丹参毛状根中得到一个AACT基因(SmAACT,accession No.EF635969),该基因全长1623bp,含有1个1200bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码399个氨基酸,对应基因组序列含有9个内含子。序列同源性分析和分子进化分析表明SmAACT是一种与植物类异戊二烯MVA途径相关的蛋白,其表达量受到生物和非生物诱导子酵母和Ag+的诱导,并伴随丹参酮类成分积累。在丹参根、茎、叶中均有表达,根中的表达量明显高于茎和叶中的表达量。单核苷酸多态性分析表明,在第6至第9内含子约600bp范围内,SmAACT共存在33个多态位点,且表现出产地特异基因型。该基因的克隆分析为研究丹参酮类成分的次生代谢调控机制奠定了基础。

独行菜幼苗叶片乙酰CoA酰基转移酶基因克隆、序列分析与原核表达

目的:研究独行菜强心苷生物合成途径的相关基因,从独行菜幼苗叶片中克隆强心苷生物合成途径关键酶乙酰CoA酰基转移酶(acetyl-CoA C-acetyltransferase,AACT)基因,进行序列分析和原核表达。方法:根据独行菜转录组数据中LaAACT基因序列设计特异性引物,克隆得到LaAACT基因的cDNA序列,构建pET-32a-LaAACT原核表达载体,诱导表达LaAACT重组蛋白。结果:LaAACT基因ORF全长为1 212 bp,编码403个氨基酸。序列分析结果显示LaAACT蛋白没有跨膜区,不含信号肽,位于细胞质中,含有硫解酶家族保守结构域。系统进化结果显示LaAACT蛋白与十字花科植物的AACT蛋白亲缘关系较近。通过IPTG诱导,在大肠埃希菌中成功表达LaAACT重组蛋白,并得到了纯化的LaAACT重组蛋白。结论:首次从独行菜幼苗叶片中克隆了LaAACT基因,建立其稳定的原核表达体系,为LaAACT蛋白抗体的制备,进一步研究LaAACT基因在独行菜强心苷生物合成途径中的功能奠定了基础。

雷公藤乙酰CoA酰基转移酶基因全长cDNA克隆及表达分析

研究根据雷公藤悬浮细胞转录组数据库设计引物,对雷公藤悬浮细胞乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase)基因Tw AACT进行全长c DNA(Gene Bank:KP297934)克隆以及生物信息学分析和基因表达分析。克隆得到Tw AACT c DNA全长为1 704 bp,编码405个氨基酸,等电点为6.10,相对分子质量为41.20 k Da,在线预测表明Tw AACT具有2个催化活性位点。雷公藤悬浮细胞经茉莉酸甲酯(Me JA)外源诱导后,通过荧光定量PCR表明,Tw AACT相对表达量明显增加,在24 h达到最高。研究首次克隆得到雷公藤AACT基因,为进一步阐述雷公藤萜类生物合成途径奠定基础。

β-酮硫解酶缺乏症3例患儿的临床及遗传学分析

目的探讨3例β-酮硫解酶缺乏症(BKTD)患儿的临床特征和基因变异。方法回顾性分析河南省儿童医院2018年1月至2022年10月诊治的3例BKTD患儿的临床表现、实验室检查及基因检测资料,分析其临床和基因变异特点。结果3例患儿均为男性,年龄为7~11个月,表现为外伤应激、感染后出现精神差、气促、呕吐、抽搐等,均存在重度代谢性酸中毒、血和尿中酮体升高、低血糖、血异戊烯酰肉碱和3-羟基异戊酰肉碱升高、尿2-甲基-3-羟基丁酸和甲基巴豆酰甘氨酸增多。基因检测提示患儿1的ACAT1基因存在c.1183G>T杂合变异与1个涉及ACAT1基因的大片段缺失(chr11:102980303_110501515),患儿2的ACAT1基因存在c.121-3C>G与c.826+5_826+9delGTGTT复合杂合变异,患儿3的ACAT1基因存在c.928G>C与c.1142T>C复合杂合变异。患儿2与患儿3的4种变异均为已知的致病性或可能致病性变异。根据美国医学遗传学与基因组学学会变异相关指南,患儿1的c.1183G>T被评级为意义不明变异(PM2_Supporting+PP3+PP4),11q22.3-11q23.1大片段缺失查询DGV正常人群拷贝数变异数据库未见收录,被评级为致病性拷贝数变异。结论ACAT1基因的变异考虑为3例BKTD患儿的遗传学病因。

杜仲EuACOTS基因家族的鉴定及生物信息学分析

乙酰CoA酰基转移酶(acetylCoA Cacetyltransferase,ACOT)是萜类化合物生物合成甲羟戊酸(mevalonate pathway,MVA)途径的起始酶,为了揭示生物合成杜仲胶的机制,对杜仲ACOTS基因家族进行全面的生物信息学分析。EuACOTS家族含有3个基因,分别记为EuACOT8、EuACOT9、EuACOT10。对其氨基酸序列的理化性质、跨膜结构域、疏水性/亲水性以及同源进化等性质进行了分析,结果发现EuACOTS蛋白质的性质结构均较为相似,均存在2个硫解酶的特异保守序列,均属于稳定的疏水蛋白,无明显的跨膜区。在对EuACOTS基因家族启动子顺式作用元件潜在功能的预测分析中发现,EuACOTS基因家族启动子顺式作用元件进行比较发现启动子作用既有保守性,又有特异性,其中EuACOTS家族含有大量基本顺式作用元件TATAbox,CAATbox以及光(AE-box、Box I、MNF1)、乙烯(ERE)、真菌诱导(Box-W1)和脱落酸(ABRE)等多个顺式调控元件。

三疣梭子蟹AACT基因克隆及其在卵巢发育中的表达分析

乙酰Co A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase,AACT)是甲羟戊酸途径的初始酶,为了研究该酶在甲壳动物卵巢发育调控中的作用,用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆得到三疣梭子蟹AACT(Pt-AACT)的c DNA全长(Gen Bank登录号:KM033231)。这段序列全长1 630 bp,包括1个101 bp的5'端非编码区,1个395 bp的3'端非编码区和1个1 134 bp的开放阅读框,编码377个氨基酸。对其氨基酸序列进行生物信息学预测,发现Pt-AACT属于疏水性蛋白,无跨膜结构域,存在2个硫解酶特异性保守区。与其他已公布物种的AACT氨基酸序列进行比对,发现与金小蜂、埃及伊蚊等同源性最高(均为72%)。系统进化树结果显示,Pt-AACT与昆虫AACT聚为一支,用实时荧光定量PCR(qRTPCR)技术,分析三疣梭子蟹AACT的组织表达差异及在卵巢发育中的表达变化,结果表明AACT在大颚器中表达量最高,在其余组织中表达量较低,差异显著;在卵巢发育Ⅰ期表达量最高,与其他期存在极显著差异。表明AACT可能在三疣梭子蟹卵巢发育中具有一定调控作用。

微藻三酰甘油合成途径及其最新研究进展

三酰甘油(triacylglycerols,TAGs)是动物、植物、微生物和微藻细胞主要的储藏性脂类,它可应用于食品、轻工业和生物燃料等方面,是一种新型可再生能源——生物柴油生产的重要原料。与高等油料作物相比,微藻具有光合作用效率高、生长速度快、油脂产量高、不占用农业耕地和适应多种生长环境等优势,是一种潜在的新型生物柴油生产原料。然而,目前人们对有机体,尤其是微藻细胞内TAG合成与积累的分子机制及细胞的代谢调控机制还知之甚少。对TAG合成的一系列重要过程,包括脂肪酸的合成,TAG生物合成的主要途径和旁路途径,以及与TAG合成相关的关键酶和重要基因等进行了综述,特别对微藻细胞中与TAG合成相关的关键基因的最新研究进展进行了总结,旨在更好地了解油脂代谢的调控途径,为最大限度地供应生物柴油的生产原料提供理论基础。

基于丹参功能基因的道地品质形成的分子机制

目的:探讨丹参功能基因单核苷酸多态性(SNP)和丹参有效成分之间的关系以及丹参药材产地特异性品质形成的分子机制。方法:以8个不同产地及变型的丹参为研究对象,采用高效液相色谱(HPLC)方法得到不同产地丹参成分指纹图谱,同时对丹参酮代谢途径中的3个功能基因丹参乙酰CoA酰基转移酶(SmAACT),4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-Derythritol kinas(SmCMK),丹参异戊烯焦磷酸异构酶(SmIPPI)的cDNA全长进行聚合酶链式反应(PCR)扩增、克隆测序以及生物信息学分析。结果:获得了8个产地及变型共23株丹参样品中3个功能基因SmAACT,SmCMK,SmIPPI的cDNA全长序列。通过对3个功能基因的SNP位点及氨基酸多态性序列分析,分别发现18,16和14个SNP位点。HPLC指纹图谱可以将8个产地的丹参聚为两大类,北京、湖北、山东白花、山西、河南、山东紫花样品聚为一支,河北与内蒙古样品聚为另一支,这也说明丹参成分变化趋势与地理距离关联不大,而变型及品种因素对质量差异的贡献率较高。结论:不同产地丹参具有明显的遗传分化趋势,并形成了各自的产地特异性基因型。通过探讨不同产地丹参药材特异性品质形成的分子机制,为保证临床用药的稳定有效奠定基础,同时为丹参优良品种选育提供指导。