丹芪化瘀方含药血清对光损伤人视网膜色素上皮细胞保护机制研究

目的:探讨丹芪化瘀方含药血清对LED冷光源致人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)光损伤的防治作用及最佳药物剂量,探寻其可能存在的保护机制。方法:应用健康的SD大鼠制备丹芪化瘀方空白血清和含药血清,将0%(空白血清)及5%、10%、15%、20%含药血清作用于ARPE-19细胞,每组设6个复孔。各组加入相应的药物于细胞恒温培养箱中培养24 h后采用CCK-8检测细胞活力,筛选最佳含药血清浓度进行后续实验。实验设置对照组、空白血清组、低剂量、中剂量、高剂量含药血清组培养,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测细胞中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测一氧化氮合成酶(NOS)、一氧化氮(NO)、血管内皮生长因子(VEGF)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测对照组、空白血清组、高剂量组iNOS的蛋白表达水平。结果:筛选出16%丹芪化瘀方含药血清作为后续实验干预浓度。与对照组比较,空白血清组iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量均升高(P<0.001),eNOS mRNA表达降低(P<0.001);随着含药血清浓度的增加细胞中iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量逐渐降低,eNOS mRNA表达增加(P<0.001),与低、中剂量组相比,高剂量组的iNOS、ET-1 mRNA表达及NOS、NO、VEGF含量显著降低(P<0.001或P<0.01或P<0.05),eNOS mRNA显著升高(P<0.001或P<0.05);空白血清组iNOS蛋白水平明显高于对照组,而16%含药血清的iNOS蛋白水平明显低于空白血清组(P<0.001)。结论:丹芪化瘀方含药血清可能通过抑制iNOS/NO途径减轻细胞损伤,上调eNOS表达,下调ET-1、VEGF的表达,抑制脉络膜新生血管形成并改善血-视网膜屏障功能,从而发挥保护作用。

丹芪化瘀方联合视网膜光凝术对糖尿病视网膜病变患者血清VEGF、CysC及ET-1的影响

目的探讨丹芪化瘀方联合视网膜光凝术对糖尿病视网膜病变患者血清血管内皮生长因子(VEGF)、胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys C)及内皮素-1(ET-1)的影响。方法将86例糖尿病视网膜病变患者随机分为2组:对照组43例给予视网膜光凝术治疗;研究组43例给予丹芪化瘀方联合视网膜光凝术治疗,2组均持续治疗2个月。比较2组治疗后临床疗效,检测2组治疗前后血糖指标、血脂指标以及VEGF、CysC和ET-1血清细胞因子水平。结果治疗后,研究组治疗总有效率显著高于对照组(P<0.05);2组空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(Hb A1 c)和餐后2h血糖(2hPG)水平均显著降低(P均<0.05),且研究组均显著低于对照组(P均<0.05);2组三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)水平均显著降低(P均<0.05)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平显著升高(P均<0.05),且研究组TG、TC和LDL-C水平均显著低于对照组(P均<0.05)、HDL-C水平显著高于对照组(P<0.05);2组VEGF、CysC和ET-1水平均显著降低(P<0.05),且研究组均显著低于对照组(P均<0.05)。结论丹芪化瘀方联合视网膜光凝术治疗糖尿病视网膜病变,可降低VEGF、CysC和ET-1水平,改善血管内皮细胞功能,疗效显著。

丹芪化瘀方对光诱导的人视网膜色素上皮细胞氧化应激的影响

目的观察丹芪化瘀方对光诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激的影响,探讨其保护视网膜的作用机制。方法2组大鼠分别以31.05 g/kg丹芪化瘀方中药颗粒水溶液和等体积蒸馏水灌胃,制备含药血清和空白血清。常规培养的RPE细胞使用白色发光二极管(LED)冷光灯于(7,500±200)LUX光照强度的下直落式照射12 h,建立RPE细胞光损伤模型,随机分为模型组(MG)、低剂量丹芪化瘀方组(L-DQHY)、中剂量丹芪化瘀方组(M-DQHY)、高剂量丹芪化瘀方组(H-DQHY),另将采用锡纸遮光的对照细胞设为对照组(CG)。CG组细胞不加任何试剂,MG组细胞加入大鼠空白血清,L-DQHY组、M-DQHY组、HDQHY组细胞分别加入4%、8%、16%浓度的丹芪化瘀方大鼠血清,培养24 h。细胞计数试剂-8(CCK-8)法检测细胞活性,流式细胞仪检测活性氧(ROS)表达,实时荧光定量PCR(RTqPCR)法检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4)mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)表达水平。结果(1)细胞活性:MG组细胞活性低于CG组(t=13.592,P=0.000),M-DQHY组、H-DQHY组细胞活性高于MG组(tM-DQHY=3.910,P=0.001;tH-DQHY=9.028,P=0.000),差异均有统计学意义。(2)ROS:MG组ROS表达水平高于CG组(t=13.457,P=0.000),L-DQHY组、MDQHY组、H-DQHY组ROS表达水平低于MG组,(tL-DQHY=7.697、tM-DQHY=8.325、tH-DQHY=13.219,均P=0.000),差异均有统计学意义。(3)NOX4 mRNA:MG组NOX4 mRNA表达水平高于CG组(t=42.469,P=0.000),L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组NOX4 mRNA表达水平低于MG组(tL-DQHY=17.238、tM-DQHY=28.764、tH-DQHY=35.210,均P=0.000),差异均有统计学意义。(4)SOD、GSH-Px、MDA:MG组MDA表达水平高于CG组(t=50.375,P=0.000),SOD、GSH-Px表达水平低于CG组(tSOD=39.847、tGSH-Px=45.431,均P=0.000);L-DQHY组、M-DQHY组、H-DQHY组MDA表达水平低于MG组(tL-DQHY=13.821、tM-DQHY=20.223、tH-DQHY=40.067,均P=0.000),SOD、GSH-Px表达水平高于MG组(SOD:tL-DQHY=8.913、tM-DQHY=14.019、tH-DQHY=28.395,均P=0.000;GSH-Px:tL-DQHY=7.860、tM-DQHY=20.350、tH-DQHY=34.127,均P=0.000),差异均有统计学意义。结论丹芪化瘀方能下调NOX4/ROS信号通路相关蛋白的表达,减少MDA表达,增加SOD、GSH-Px的表达,起到有效拮抗LED对RPE细胞的氧化损伤作用。