主动外排系统介导的大肠杆菌多重耐药性的确证

为检测和证实主动外排系统 (外输泵 )在细菌多重耐药机制中的作用 ,用四环素和水杨酸钠对大肠杆菌质控株进行了体外人工诱导 ,筛选出多重耐药株 ,再用能量抑制剂 CCCP(Carbongl cyanide m- chloropheyhydrazone)对耐药株和质控株进行了环丙沙星摄取抑制试验。结果 :在耐药株 ,其菌体内环丙沙星稳态浓度明显低于质控株 ;多重耐药株在有 CCCP存在时 ,菌体内环丙沙星的浓度随时间的延长而递增 ,而无 CCCP的抑制时 ,菌体内环丙沙星的浓度递增缓慢 ;在质控株 ,不论有无 CCCP存在 ,菌体内环丙沙星的浓度都随时间的延长而呈递增趋势 ,且保持较耐药株明显高的水平。结论 :体外诱导多重耐药大肠杆菌多重耐药性的产生 。

10种单味中药对鲍曼不动杆菌的抗菌作用和对主动外排机制抑制作用的研究

目的:研究10种单味中药对临床分离的鲍曼不动杆菌的抗菌作用和对主动外排机制的抑制作用。方法:收集2011年1月至2011年12月宁波市第一医院患者临床标本中分离到的20株鲍曼不动杆菌,按照耐药性把20株菌分为多重耐药组和敏感组,每组10株。先检测10种单味中药对鲍曼不动杆菌的抑菌作用,再分别用外排抑制剂氰氯苯腙(终浓度15 mg/L)、利血平(终浓度20 mg/L)检测四环素和氯霉素外排泵表型,抗生素MIC值比空白对照下降4倍或以上时判为外排泵表型阳性。然后用终浓度2 000g/L的10种单味中药做外排抑制剂,检测四环素和氯霉素MIC值是否比空白对照下降4倍或以上。最后对数据进行统计分析。结果:10种单味中药对鲍曼不动杆菌都有不同程度的抑菌作用,黄岑和连翘的抑菌作用最强,金银花、三叶青、大青叶、黄连、野菊花的抑菌作用稍弱;焦栀子、蒲公英、紫花地丁的抑菌作用较弱。金银花、连翘、三叶青、焦栀子、大青叶、野菊花、蒲公英这7味中药对两组菌的抑菌作用有统计学差异(P<0.05):对敏感组菌的MIC_(50)和MIC_(90)都明显低于多重耐药组,而黄连、紫花地丁、黄岑对两组菌的抑菌作用无显著差异(P>0.05)。两组鲍曼不动杆菌对四环素和氯霉素的外排泵表型阳性率高,终浓度2 000 g/L的10种单味中药对氯霉素和四环素没有外排抑制作用。重新配制并提高本试验中10种单味中药水煎液浓度至终浓度为20 000 g/L,对氯霉素和四环素仍然没有外排抑制作用。结论:中药对鲍曼不动杆菌有抑菌作用,可作为抗生素的辅助用药。主动外排机制是鲍曼不动杆菌对四环素和氯霉素耐药的一种重要机制,但在20 000 g/L的浓度下,10种单味中药对氯霉素和四环素没有外排抑制作用。

铜绿假单胞菌主动外排系统MexAB-OprM与耐药的关系研究

目的 研究铜绿假单胞菌对碳青酶烯类抗生素的耐药机制。方法 以亚胺培南为代表 ,应用逆转录 (RT) PCR方法并设置内参照 ,分别研究临床分离的铜绿假单胞菌亚胺培南耐药株和亚胺培南敏感株的主动外排系统MexAB OprM中OprM的结构基因OprM的mRNA表达水平。结果 耐药组OprM的mRNA表达水平明显高于敏感组。结论 主动外排系统MexAB OprM的表达水平增高或异常增多与铜绿假单胞菌对以亚胺培南为代表的碳青酶烯类抗生素耐药密切相关。

主动外排系统acrAB在志贺菌中分布和表达

目的研究志贺菌患者分离株的多重耐药机制。方法检测志贺菌中有无主动外排系统acrAB-tolC结构基因acrAB-tolC在临床分离菌株中的分布;Northern-blots测定acrAB-tolCmRNA表达水平。结果所有志贺菌分离株染色体中均发现有acrAB-tolC基因,未发现acrAB-tolC基因缺失株;发现4株多重耐药株acrA基因实变,1株敏感野生tolC基因突变,未发现acrB基因突变株。多重耐药株acrA基因mRNA水平显著高于敏感野生株(P<0.05),acrB基因和tolC基因mRNA水平与敏感野生株差异无统计学意义(P>0.05)。结论主动外排系统acrA基因高表达导致临床分离志贺菌产生多重耐药性;acrAB-tolC的表达可能受多种耐药操纵子调控。

主动外排机制在鲍曼不动杆菌耐药性中的作用

目的探讨细菌主动外排机制在临床分离的鲍曼不动杆菌耐药性中的作用。方法琼脂稀释法检测临床分离的鲍曼不动杆菌对常用抗生素的耐药性,测定经外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)处理前后鲍曼不动杆菌对抗生素最小抑菌浓度(MIC)的变化,以聚合酶链反应(PCR)、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测多重耐药主动外排基因adeB及其表达水平。结果临床分离的鲍曼不动杆菌对常用抗生素耐药率高且具有多重耐药性,并存在药物的主动外排。所有临床分离的菌株均能检测到adeB基因,但多重耐药株表达水平明显高于敏感株(P<0.01)。结论临床分离的鲍曼不动杆菌的耐药性尤其是多重耐药性与外排泵介导的耐药机制密切相关。

铜绿假单胞菌MexAB-OprM主动外排表型筛选和外排基因检测

目的研究解放军总医院临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌的主动外排系统,为指导临床合理选择抗生素提供依据。方法采用外排泵抑制剂(苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺)与喹诺酮类抗生素,以微量肉汤稀释法测定加与不加外排泵抑制剂时环丙沙星与左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC)值,并计算MIC值的变化,根据加与不加外排泵抑制剂MIC值降低3个稀释度及以上筛选主动外排表型阳性菌株;PCR扩增外排表型阳性菌的耐药基因oprM、mexB和mexR,并对3株菌进行mexR基因测序分析;RT-PCR检测oprM基因的mRNA水平,分析耐药基因的表达情况。结果苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺能极大的降低左氧氟沙星和环丙沙星的MIC值,70株多重耐药铜绿假单胞菌中46株表型阳性(65.7%),其中PCR检测oprM、mexB和mexR基因同时阳性菌株42株(91.3%),仅oprM基因阳性2株(4.3%),oprM、mexB和mexR基因均阴性2株(4.3%)。RT-PCR产物测定A值(A260/A280)与PAO1对照阳性菌株13株,以PAO1的oprM/rpoD的A值为对照阳性菌株4株,同时满足A值(A260/A280)和oprM/rpoD比值均高于PAO1的菌株3株。测序结果与GenBank中已知的mexR基因比对,其中2株同源性为100%,1株第434位核苷酸插入2bp(AT)。结论中国人民解放军总医院多重耐药铜绿假单胞菌大多存在主动外排的耐药机制,其耐药与外排泵过度表达相关。

泵抑制剂对嗜麦芽寡养单胞菌氟喹诺酮主动外排表型特征的影响

目的:探讨主动外排泵在嗜麦芽寡养单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药中的作用。方法:用泵抑制剂氰氯苯腙(CCCP)和利血平对5种氟喹诺酮类药物抗菌活性进行干预。采用琼脂二倍稀释法检测泵抑制剂存在时,嗜麦芽寡养单胞菌对莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星敏感性的变化。结果:主动外排泵不仅存在于耐药菌株,而且也存在于敏感菌株,但对耐药菌株影响更大。与泵阴性组比较,泵阳性组敏感率降低在左氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星组有统计学差异;耐药率增加在洛美沙星、环丙沙星组有统计学差异。结论:主动外排泵抑制剂CCCP和利血平可增强氟喹诺酮类药物对嗜麦芽寡养单胞菌的抗菌活性,对其耐药表型有影响。主动外排机制是嗜麦芽寡养单胞菌对氟喹诺酮类药物耐药的原因之一。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的主动外排系统基因qacA/B的检测及其意义

目的:应用半巢氏聚合酶链式反应(PCR)技术检测临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)主动外排系统qac基因,了解qac基因的存在状况。方法:根据MRSA主动外排系统qacA和qacB基因序列设计引物,采用半巢氏PCR法对中南大学3所附属医院2006年8月至2008年3月临床分离的80株MRSA分别扩增qacA/B和qacB基因,并进行序列分析。结果:在80株受检MRSA中,检出qacA/B基因19株,检出率23.75%;qacB基因18株,检出率22.5%。序列分析显示,qac基因与qacA的参考序列(X56628)98%相同,与参考序列qacB(AF535087)97%相同。结论:半巢氏PCR法可成功检测MRSA的主动外排系统qac基因。qac基因阳性株在临床分离的MRSA中占有较高的比例,可能与其多重耐药有关。

耐药白念珠菌主动外排泵蛋白的功能与基因表达

目的:研究耐药白念珠菌主动外排泵蛋白的功能及其基因表达情况。方法:微量稀释法测定4种抗真菌药物对20株白念珠菌的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC);检测罗丹明分别在对氟康唑敏感和耐药的白念珠菌中的外排情况,筛选出罗丹明6G外排明显增加的耐药菌株;用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测主动外排泵基因CDR1和CDR2的表达水平。结果:在加入葡萄糖提供能量后,有些对氟康唑耐药的菌株外排罗丹明6G增加,而在这些菌株中,主动外排泵基因CDR1和CDR2的表达水平均显著高于敏感株。结论:白念珠菌对氟康唑的耐药性与主动外排泵基因过度表达相关;测定白念珠菌中罗丹明6G的外排情况,是筛选主动外排泵基因过度表达的耐药菌株的一种有效方法。

鲍曼不动杆菌主动外排系统AdeABC、AdeIJK与多重耐药相关性

了解本地区鲍曼不动杆菌主动外排系统的分布并探讨其在介导细菌多重耐药中的作用。方法琼脂二倍稀释法检测20种抗菌药物对鲍曼不动杆菌临床分离株的MIC;PCR扩增AdeABC-AdeRS、AdeUK两种RND主动外排系统的结构和调节基因。结果112株鲍曼不动杆菌临床分离株对亚胺培南/西司他丁和美罗培南耐药率分别为0.9%和1.8%,对大多数抗菌药物的耐药率均大于60%,但对多黏菌素B和米诺环素均敏感。75.9%的菌株同时检出adeABC-adeRS和adeIJK主动外排基因,6.3%仅检出adeIJK。同时检出adeABC-adeRS和adeIJK的菌株耐药率较高。结论本地区鲍曼不动杆菌临床分离株多重耐药情况严重。adeABC和adeIJK在鲍曼不动杆菌临床分离株有较高检出率。AdeABC主动外排系统在鲍曼不动杆菌多重耐药性的形成中起重要作用。

主动外排系统acrAB在临床分离肺炎克雷伯菌中的分布和表达

目的:研究临床分离多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制,检测肺炎克雷伯菌中有无类似大肠埃希菌主动外排系统AcrAB的结构基因acrAB的分布和表达。方法:用聚合酶链反应(PCR)检测acrAB基因在临床分离的肺炎克雷伯菌和肺炎克雷伯菌标准菌株(ATCC 10031)中分布,用逆转录(RT)-PCR测定其 mRNA表达水平,并对 PCR扩增的 ATCC 10031的acsAB基因片段进行序列分析,同大肠埃希菌acrAB基因的相应序列进行同源性比较。结果:在所有被检的临床分离肺炎克雷伯菌和 ATCC 10031的染色体中均发现有类似大肠埃希菌的 acrAB基因;肺炎克雷伯菌多重耐药菌株 acrAB的 mRNA水平显著高于敏感野生株和耐药谱不同的菌株,而耐药谱不同的菌株仅略高于敏感菌株;PCR扩增的 ATCC 10031的 acrAB基因片段同大肠埃希菌acrAB基因相应片段,在核苷 序列上具有很高的同源性。结论:本研究表明在肺炎克雷伯菌中有类似大肠埃希菌的acrAB基因存在,其表达水平决定了多重耐药表型。

伤寒沙门菌主动外排多重耐药基因acrB与表达水平研究

目的调查临床分离伤寒沙门菌对常用抗生素的耐药情况与多重耐药主动外排基因acrB的检测、序列分析及其表达水平。方法根据NCCLS推荐的琼脂二倍稀释法测定7种抗生素对伤寒沙门菌的抗菌活性,以基因库序列为参考设计引物PCR扩增acrB、测序并用RT-PCR方法检测其表达水平。结果32株伤寒沙门菌对氧氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟、哌拉西林、氯霉素、四环素、庆大霉素的耐药率分别为0、0、0、28.13%、43.75%、40.63%和12.5%,其中多重耐药菌10株。所有细菌均检测到多重耐药外排基因acrB,测序显示与参考沙门菌序列(N o.AL 627267)比较,有2处碱基变异。与大肠埃希菌(N o.ECU 00734)比较,碱基同源性为85.51%(61/421),提示其碱基序列同源性极高。对不同种类抗生素耐药及不耐药部分伤寒沙门菌共16株进行一步法RT-PCR检测acrB表达水平,结果所测伤寒沙门菌均检测到多重耐药外排基因acrB的表达,多重耐药株主动外排的表达较其它菌株明显增强。结论伤寒沙门菌对喹诺酮类、第三代头孢菌素类耐药率低,对哌拉西林、氯霉素、四环素耐药率相对较高,且有多重耐药。伤寒沙门菌中均存在acrAB主动外排系统,acrB与大肠埃希菌同源性高,对不同结构抗生素耐药的种类越多,表达水平越高。主动外排机制可能是伤寒沙门菌多重耐药的主要原因之一。

主动外排系统与阴沟肠杆菌多重耐药关系的研究

目的观察泵抑制剂氰氯苯腙对阴沟肠杆菌耐药水平的降低作用,并扩增外排基因,以探讨主动外排系统的基因分布及与阴沟肠杆菌多重耐药的关系。方法采用琼脂稀释法测定氰氯苯腙应用前后83株阴沟肠杆菌对头孢他啶、阿米卡星、阿奇霉素、左氧氟沙星、四环素的最小抑菌浓度变化,PCR扩增外排系统基因acrA、acrB、toiC,PCR产物连接转化后采用sanger末端终止法进行测序。结果以上述5种抗生素为底物,分别有30、36、19、32、28株显示外排表型阳性。PCR扩增结果显示,分别有55、57、62株菌检测得到acrA、acrB、toiC,并通过测序证实。结论主动外排泵抑制剂可降低阴沟肠杆菌对抗生素的耐药水平,相对于非多重耐药株,外排泵对多重耐药株的影响较大。主动外排系统是阴沟肠杆菌多重耐药的重要机制之一。

抗生素耐药性的主动外排机制

细菌对抗生素产生耐药性的机制多种多样 ,常见的有 :细菌产生酶对抗生素的修饰与灭活 ;药物作用靶点发生改变 ;膜通透性下降 ;膜产生主动外排作用 ;生物被膜的形成。膜的主动外排机制是由各种外排蛋白系统介导的把抗生素等药物从细菌细胞内泵出的主动排出过程 ,外排系统具有能量依赖性、底物广泛性、系统多样性及功能复杂性的特点 ;与常用抗生素、合成抗菌药、染料、去污剂及金属离子的多重耐药性密切相关 ,尤其对四环素、氯霉素及氟喹诺酮类药物等广谱抗菌药的作用更为明显 ;其生理功能与正常物质转运和代谢有关。以利血平为代表的外排泵抑制剂能有效地对抗主动外排作用的产生 ,此类抑制剂将是防制细菌多重耐药性的有效措施之一。

奥美拉唑对耐氧氟沙星的铜绿假单胞菌主动外排泵的抑制作用

目的研究奥美拉唑作为主动外排泵抑制剂提高铜绿假单胞菌对氧氟沙星的敏感性。方法二倍稀释法筛选临床分离的铜绿假单胞菌,测定耐氧氟沙星菌株对主动外排泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)和加入奥美拉唑后的敏感性。将CCCP和奥美拉唑分别加入铜绿假单胞菌培养液,分为单纯培养的铜绿假单胞菌组、铜绿假单胞菌+CCCP组、铜绿假单胞菌+奥美拉唑组,用RP-HPLC测定分别加入CCCP和奥美拉唑后的0.17、0.50、0.75、1、3、8、15、30、60 min时铜绿假单胞菌菌体内摄取氧氟沙星的含量。结果在不同时间点,铜绿假单胞菌+CCCP组和铜绿假单胞菌+奥美拉唑组菌体内摄取的药量均显著高于铜绿假单胞菌组。结论奥美拉唑作为主动外排泵抑制剂,可增强铜绿假单胞菌对氧氟沙星的敏感性。

主动外排抑制剂对大肠杆菌耐药性逆转的研究

应用琼脂稀释法检测大肠杆菌质控株和耐药株在加入主动外排抑制剂碳酰氰间氯苯腙(CCCP)后对环丙沙星、恩诺沙星、四环素的最低抑菌浓度(MIC)变化情况。结果发现,在加入CCCP后,大肠杆菌质控株对上述3种抗菌药物的MIC无变化,多数耐药株对四环素MIC变化不大,而CCCP可使耐药株分别对环丙沙星和恩诺沙星的MIC变化较大,其中耐药菌S17对这两种药物的MIC均减小8倍。本研究结果提示,主动外排抑制剂CCCP与抗生素联合应用可降低大肠杆菌对抗生素耐药的发生率。

甲型副伤寒沙门氏菌主动外排多重耐药基因与表达研究

目的调查临床分离甲型副伤寒沙门氏菌对常用抗生素的耐药情况与多重耐药主动外排基因acrB的检测、序列分析及其表达水平。方法用琼脂二倍稀释法测定7种抗生素对甲型副伤寒沙门氏菌的抗菌活性,以基因库序列为参考设计引物PCR扩增acrB、测序并用RT-PCR方法检测其表达。结果12株甲型副伤寒沙门氏菌对氧氟沙星、环丙沙星、头孢噻肟、哌拉西林、氯霉素、四环素、庆大霉素的耐药率除氯霉素为0外,其余均为8.33%。对三类不同种类抗菌药物多种耐药者1株。所有细菌均检测到多重耐药外排基因acrB,测序结果与参考沙门氏菌序列(No.AL627267)比较,有1处碱基差异。与大肠埃希氏菌(No.ECU00734)比较,碱基同源性为84.41%(70/449),提示其碱基序列同源性均极高。分别选取对两类抗菌药物耐药及敏感甲型副伤寒沙门氏菌各一株进行RT-PCR检测,结果两株细菌均检测到多重耐药外排基因acrB的表达。结论甲型副伤寒沙门氏菌对喹诺酮类、第三代头孢菌素类等药物耐药率低,但有多重耐药。甲型副伤寒沙门氏菌中均存在acrAB主动外排系统,与大肠埃希氏菌同源性高,可检测到其表达。主动外排机制可能是甲型副伤寒沙门氏菌形成多重耐药的主要原因之一。

鲍曼不动杆菌的多重耐药性与主动外排系统

鲍曼不动杆菌的多重耐药现象日益严重,给临床抗菌药物的应用带来威胁,其多重耐药机制复杂,其中主动外排是主要原因之一。该文系统综述易化子超家族、耐药结节分化超家族和多药及毒物外排家族的5种主动外排系统的结构,外排机制及调节通路,分析多重耐药与主动外排系统的关系,为新型抗菌药物的设计提供新思路。