人主动脉-性腺-中肾区基质细胞诱导胚胎干细胞分化为造血干细胞及体内造血重建

背景:研究证实多种造血生长因子、基质细胞饲养层及其条件培养液可促进胚胎干细胞向造血干细胞分化。目的:以人主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区基质细胞为饲养层体外诱导小鼠胚胎干细胞分化为造血干细胞,并比较不同移植途径对造血干细胞体内造血重建能力的影响。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体,采用Transwell非接触共培养体系在人AGM区基质细胞饲养层上诱导6d,接种NOD-SCID小鼠检测体内致瘤性。再将诱导后的拟胚体细胞移植经致死量60Coγ射线辐照的BALB/C雌鼠,受鼠随机分为静脉移植组、骨髓腔移植组、照射对照组及正常对照组。结果与结论:拟胚体细胞经人AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞占(13.12±1.30)%。NOD-SCID小鼠皮下接种经人AGM区基质细胞诱导的拟胚体细胞可出现畸胎瘤,经骨髓腔接种未见肿瘤形成。静脉移植组动物全部死亡,骨髓腔移植组生存率为55.6%,移植后21d外周血象基本恢复,存活受鼠检测到供体来源Sry基因。提示小鼠胚胎干细胞经人AGM区基质细胞诱导分化的造血干细胞通过骨髓腔移植安全并具有一定的造血重建能力。

AGM区基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化的实验研究

目的探讨主动脉-性腺-中肾(AGM)区来源的基质细胞诱导胚胎干细胞(ESC)向成血-血管干细胞分化的促进作用。方法从孕11 d的小鼠胚胎AGM区分离、培养基质细胞,鉴定后用作支持细胞,与小鼠胚胎干细胞共同培养,通过原始细胞集落(BL-CFC)的形成情况及流式细胞仪检测CD34+/Flt-1+细胞比例,评价AGM区基质细胞对小鼠ESC-D3细胞系向成血-血管干细胞的定向诱导作用。结果在AGM区基质细胞的支持下,由ESC来源的CD34+细胞由(12.71±1.76)%增加到(39.71±3.76)%,并且CD34+/Flt-1+细胞比例明显提高,达到(26.59±1.77)%;同时由ESC来源的代表成血-血管干细胞的BL-CFC集落增加了3倍。结论AGM区基质细胞可促进胚胎干细胞向成血-血管干细胞分化,探明其机制对研究造血及血管发育机制有积极意义。

Transwell培养体系中人AGM区基质细胞支持脐血CD34^+细胞造血

【目的】探讨Transwell系统中人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐带血造血干/祖细胞的造血能力长期维持及扩增的作用。【方法】采用免疫磁珠方法分离人脐带血CD34+细胞,接种于底层铺有人AGM区基质细胞的Transwell培养板的Inserts中,非接触共培养7-35 d,每星期取样检测细胞总数,用半同体培养基分析CFU-C及HPP-CFU集落形成数,流式细胞术检测CD34+、CD34+CD38-细胞百分率。【结果】在Transwell中非接触共培养条件下,人AGM区基质细胞培养体系较胚胎躯干基质细胞和无饲养层培养体系对有核细胞总数、CFC和CD34+细胞均具有明显的扩增作用,共培养14 d的CD34+、CD34+CD38-造血干/祖细胞均获得峰值扩增(2.62±0.8和2.15±1.04,P<0.05),而MNC总数和CFC均在21 d获得最大扩增(32.5±4.3和4.2±0.6倍,P<0.05).克隆分析发现CFU-Mix、CFU-GM、BFU-E在共培养4-5星期后均仍然可见。原始祖细胞HPP-CFC在3星期也得到2.23倍的扩增,较空白及hFT对照组均有显著性差异(P<0.05),并在共培养35 d 后仍可见HPP-CFU集落形成。【结论】人AGM区基质细胞hAGM-S3/hAGM-S4均具有造血支持作用,在非接触共培养条件下中可长期维持脐血中造血干/祖细胞的多系造血能力和高增殖潜能达21～35 d,对脐血CD34+/

人胚AGM区造血干／祖细胞的分离及其在含AGM区基质细胞体系中的培养

本研究分离人胚主动脉-性腺-中肾(AGM)区造血干/祖细胞(HSPC)并在含人AGM区基质细胞的培养体系中进行培养,以了解人AGM区基质细胞对HSPC的作用。以免疫组织化学方法检测人胎龄28-45天胚胎AGM区细胞CD34、Flk-1、VEGF的表达;分离AGM来源的HSPC,通过直接接种和经Transwell非直接接触两种方法接种于含人AGM区基质细胞系(hAGMS3和hAGMS4)饲养层的培养体系,观察HSPC生长情况和卵石区形成细胞(cobblestone area-forming cells,CAFC)并计数卵石区(cobblastone area,CA);用间接免疫荧光方法检测培养体系中悬浮细胞和CAFC的CD34、Flk-1表达;收获细胞进行半固体造血集落培养以检测两种培养方法对AGM-HSPC的集落形成能力影响。结果表明:人AGM区造血细胞表达CD34和Flk-1。两种接种方法均显示有CFC形成,直接接触培养能形成CD34和Flk-1双阳性的CAFC,集落总数明显高于非接触培养(hAGMS3体系:1647±194vs389±31,p<0.05;hAGMS4体系:1586±75vs432±35,p<0.05)。结论:①人胚AGM区含有CD34+Flk-1+的HSC。②首次建立含人胚AGM基质细胞的AGM-HSPC培养体系,直接接触培养和非直接接触培养均能促进AGM-HSC的生长,AGM基质细胞与HSC直接接触发挥重要作用。

BMP-4在人AGM区基质细胞的表达

本研究旨在观察BMP-4在人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞的表达,为建立含AGM区基质细胞的诱导胚胎干细胞造血分化培养体系提供理论和实验依据。体外传代培养人胚胎AGM区基质细胞(hAGM S1-S5)及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞(hFT),采用RT-PCR方法在mRNA水平分析BMP-4在hAGM S1-S5的表达情况,并应用ELISA方法测定BMP-4在hAGM S1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,同时以hFT细胞作为对照。结果表明:体外培养中的hAGM S1-S5细胞形态学表现主要为成纤维间质细胞样,少量呈内皮样,是早期胚胎AGM区来源的异质细胞群。hAGM S1-S5细胞均表达BMP-4 mRNA,hFT不表达BMP-4 mRNA。hAGM S1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的BMP-4,其分泌水平(pg/ml)分别为55.98±11.20、61.16±9.39、76.26±11.31、86.38±18.34、85.39±21.22,与hFT对照组(16.76±7.04pg/ml)相比有显著性差异(p<0.05),hAGM S1-S5组间比较BMP-4水平无显著性差异(p>0.05)。结论:体外培养中的人AGM区基质细胞表达BMP-4,与AGM区基质细胞支持造血干细胞原始发生的功能相关。

人AGM区基质细胞对脐血CD34^+细胞形成HPP-CFU能力的支持作用

目的探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血CD34+细胞形成高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)能力的支持作用。方法采用免疫磁珠方法分离人脐血CD34+细胞,接种于底层已制备好人AGM区基质细胞S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维细胞hFT为对照,体外培养28天,每7天收获细胞行造血细胞集落培养。结果5株人AGM区基质细胞hAGMS1～S5对HPP-CFU均有不同程度的扩增及维持作用,HPP-CFU在培养14天达到峰值,与无饲养层组、hFT组比较差异有统计学意义(P<0.05)。hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5。结论人AGM区基质细胞S1～S5对脐血CD34+细胞形成HPP-CFU的能力具有支持作用,特别是hAGNS3、S4两株细胞具有更好的造血干性维持作用,为胚胎早期造血发生机制研究提供了重要的模式细胞和基础资料。

小鼠胚胎AGM区Flk-1^+细胞的造血特性

本研究旨在考察Flk-1分子在胚胎期10.5 d(E10.5)的主动脉-性腺-中肾区(AGM区)不同类型造血前体细胞的表达情况。通过流式细胞术分析发现低于10%的Flk-1+细胞与CD41、CD45/Ter119有共表达,继而分选出CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41+(R1,代表不成熟的造血前体细胞)和CD31+CD45-Ter119-Flk-1+CD41-(R2,代表内皮细胞)两群细胞,利用造血集落培养和OP9共培养体系分别考察其体外的髓系与淋系潜能。结果表明:仅R1组细胞能在造血集落培养体系中形成典型的造血集落,但与OP9共培养7-9 d后,两组细胞均能产生丰富的造血前体细胞(CD45+c-Kit+)、髓系细胞(Gr-1+/Mac-1+)、红细胞(Ter119+)和B淋巴细胞(CD19+)。结论:E10.5的小鼠胚胎AGM区Flk-1仍然在幼稚的造血前体细胞以及更早期的生血内皮细胞表达,但是此时的造血干细胞前体和造血干细胞是否表达Flk-1仍需通过体内功能实验明确。

RNA结合蛋白Rbm38在小鼠胚胎造血发育中的功能研究

目的:探究RNA结合蛋白Rbm38在小鼠造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)发育中的作用。方法:分析造血干细胞发育过程中连续群体的单细胞转录组数据,筛选生血内皮细胞(hemogenic endothelial cell,HEC)和/或造血干细胞前体(hematopoietic stem cell precursor,pre-HSC)阶段表达上调的RNA结合蛋白分子(RNA binding protein,RBP);利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除小鼠模型,将杂合型小鼠交配获得实验用胚胎,按照小鼠胚胎基因型不同将实验分为实验组和对照组,实验组为Rbm38^(-/-)基因型胚胎,对照组为Rbm38^(+/+)和Rbm38^(+/-)基因型胚胎;取材胚胎期11.5 d(embryonic day 11.5,E11.5)孕鼠胚胎的卵黄囊(yolk sac,YS),行体外造血细胞集落形成实验(colony forming unit-culture,CFU-C)检测主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和卵黄囊生成造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)的能力,行小鼠胚胎AGM区移植实验评价AGM区产生功能性造血干细胞的能力。结果:(1)Rbm38在动脉内皮细胞(arterial endothelial cell,AEC)向生血内皮细胞和Ⅰ型造血干细胞前体(type 1 pre-hematopoietic stem cell,T1 pre-HSC)的转化过程中表达明显上调,且在后续造血干细胞成熟的过程中维持高水平表达;(2)实验组和对照组E11.5小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞数量以及其分化功能无统计学差异(P>0.05);(3)实验组和对照组移植后外周血嵌合率无统计学差异(P>0.05)。结论:(1)多种RNA结合蛋白分子,如Rbm38,在小鼠生血内皮细胞与Ⅰ型造血干细胞前体阶段特异性高表达;(2)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区和卵黄囊生成造血祖细胞的能力;(3)敲除Rbm38不影响小鼠胚胎AGM区产生功能性的造血干细胞。

含人AGM区、胎肝及骨髓基质细胞培养体系程序化诱导小鼠胚胎干细胞向造血干细胞的分化

背景:前期已分别制备人主动脉-性腺-中肾区基质细胞系及胎肝基质细胞系,发现前者可促进小鼠胚胎干细胞定向分化为造血干细胞。目的:模拟胚胎发育过程中永久造血发育的时空顺序,探讨人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞对小鼠胚胎干细胞体外诱导分化为造血干细胞的支持作用,以寻求更佳的诱导条件。方法:将小鼠E14胚胎干细胞诱导为拟胚体(EB),并利用Transwell非接触共培养体系依次在人主动脉-性腺-中肾区、胎肝及骨髓基质细胞饲养层上进一步诱导分化,按不同诱导阶段分为拟胚体对照、EB/AGM、EB/AGM+FL和EB/AGM+FL+BM共4组。共培养6d后分别收获各组拟胚体来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,进行各系造血细胞集落形成单位分析并观察细胞形态。结果与结论:①EB/AGM+FL组和EB/AGM+FL+BM组收获细胞涂片均发现原始造血细胞。②拟胚体来源细胞经AGM区基质细胞诱导后Sca-1+c-Kit+细胞明显升高(P<0.05)。③拟胚体对照组造血细胞集落形成单位低于其他各组(P<0.05),而EB/AGM+FL、EB/AGM+FL+BM组造血细胞集落形成单位计数亦较EB/AGM组明显增高。提示AGM+FL和AGM+FL+骨髓基质细胞微环境对原始造血干细胞的扩增效应均明显高于单纯主动脉-性腺-中肾饲养层。

按造血发育程序诱导小鼠胚胎干细胞为造血干细胞重建体内造血的实验研究

为研究小鼠胚胎干细胞(ESC)定向诱导分化为造血干细胞(HSC)在体内重建造血的功能,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),EB细胞利用Transwell非接触共培养体系在人主动脉-性腺-中肾(AGM)区、胎肝(FL)及骨髓(BM)基质细胞饲养层上依次诱导,收获各阶段EB细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-Kit+细胞含量,并接种于NOD-SCID小鼠以检测体内致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植到经致死量60Coγ射线照射的BALB/c雌鼠,将受鼠随机分为5组:①AGM组,②AGM+FL组,③AGM+FL+BM组,④照射对照组,⑤正常对照组。观察各组生存率、造血重建和植入状况。结果显示:EB细胞经人AGM区和FL基质细胞共培养后Sca-1+c-Kit+细胞达到峰值(21.96±2.54)%;NOD-SCID小鼠在接种经人AGM区基质细胞诱导的EB细胞后可出现畸胎瘤,而接种经人AGM区+FL基质细胞诱导EB细胞后未见肿瘤形成;AGM组及照射对照组动物全部死亡,而AGM+FL组及AGM+FL+BM组生存率分别为77.8%、66.7%,移植后21天外周血象基本恢复,在存活受鼠检测到供体来源Sry基因。结论:按胚胎造血发育程序,体外经人AGM区、FL及BM基质细胞连续诱导小鼠ESC分化的HSC可安全、有效地重建体内造血。

Notch4信号在小鼠胚胎早期造血发育的表达

目的:探讨小鼠胚胎发育过程早期造血组织中Notch4信号的基因与蛋白的表达情况。方法:采用PT-PCR和Western blot方法,对小鼠胚胎孕9.5 d(E9.5)、E10.5、E11.5、E12.5胚胎的主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区和胎肝中Notch4信号基因和蛋白的表达进行检测。结果:2组小鼠早期造血相关组织的Notch4 mRNA与蛋白表达,在AGM区E10.5组较其它组明显增高(P<0.05);在AGM区和胚胎中都是随着孕龄的增大而逐渐减低(P<0.01)。AGM区与胚胎中比较,在9.5 d和12.5 d有统计学意义(P<0.05);在10.5 d与11.5 d无统计学意义(P>0.05)。PT-PCR结果显示表达规律相同。结论:Notch4信号在小鼠胚胎早期造血组织中有表达,但其功能有待进一步研究。

体外培养的人AGM区基质细胞表达多种造血生长因子

本研究检测人胚胎主动脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞表达的造血生长因子,为探讨AGM区基质细胞在胚胎造血发生中的作用及其造血支持作用提供基础资料。采用RT-PCR方法在mRNA水平分析IL-6、SCF、Flt3-L、OSM、IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子在人AGM区基质细胞(hAGMS1-S5)的表达情况,应用ELISA法测定IL-6、SCF、Flt3-L在hAGMS1-S5细胞培养上清液中的分泌水平,并将脐血CD34+细胞与hAGMS1-S5饲养层细胞共培养14天后行造血细胞集落培养以进一步检测人AGM区基质细胞的造血支持作用。结果表明:hAGMS1-S5均表达IL-6、SCF、Flt3-L、OSM等造血生长因子mRNA,不表达IL-3、TPO、M-CSF、LIF等因子mRNA。在hAGMS1-S5细胞培养上清液中可测得分泌的SCF、Flt3-L、IL-6等因子,hAGMS1-S5组间比较各因子水平无显著性差异(P>0.05)。集落培养结果表明,hAGMS1-S5对CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix均有不同程度的扩增作用,hAGMS1-S5的造血支持作用组间比较亦显示有显著性差异(P<0.05),其中hAGMS3、S4优于S1、S2及S5。结论:人AGM区基质细胞表达SCF、Flt3-L、IL-6、OSM等多种造血生长因子,这可能与AGM区基质细胞支持造血细胞原始发生和体外维持造血干细胞功能相关。

人AGM区及胎肝基质细胞促进小鼠胚胎干细胞向造血干细胞分化和体内造血重建

目的:探讨小鼠胚胎干细胞(ESCs)经人主动脉-性腺-中肾(AGM)区及胎肝(FL)基质细胞程序诱导后,向造血干细胞(HSCs)分化的效率及其造血功能。方法:将E14 ESCs诱导为拟胚体(EB),并在人AGM区及FL基质细胞饲养层上进一步诱导分化,培养6 d后收集细胞检测Sca-1+c-Kit+细胞含量、分析造血细胞集落形成能力及致瘤性。再将不同诱导阶段的EB来源细胞移植经致死量[60Co]γ射线辐照的BALB/c雌鼠,观察生存率、植入状况和造血重建。结果:(1)EB来源细胞经人AGM区及FL基质细胞程序诱导后Sca-1+c-Kit+细胞含量为(21.96±2.54)%,造血集落总数为(520±52)/105cells,明显优于诱导前及人AGM区基质细胞初步诱导者(P<0.05)。(2)NOD-SCID小鼠接种经人AGM区及FL基质细胞诱导的ESCs未见畸胎瘤。(3)BALB/c雌鼠移植经人AGM区及FL基质细胞诱导的EB来源细胞后生存率77.8%,14 d外周血细胞计数明显改善,存活受鼠均检测到供体来源sry基因,而移植人AGM区基质细胞诱导的EB细胞者15 d内全部死亡。结论:人AGM区及FL基质细胞能促进小鼠ESCs定向分化为HSCs,有效重建体内造血功能。

含人AGM区基质细胞对小鼠胚胎干细胞诱导体外分化为造血干/祖细胞的作用

为探讨人主动脉一性腺一中肾(AGM)区基质细胞对小鼠胚胎干细胞(em bryonic stem cells,ESC)体外诱导分化为造血干细胞(HSC)的影响及其作用机制,将小鼠E14ESC诱导为拟胚体(EB),收获的EB细胞以Transw ell非接触共培养体系分别在人AGM区、胎肝(FL)或骨髓(BM)基质细胞饲养层上进一步诱导分化,分为EB对照、AGM诱导、FL诱导、BM诱导、AGM+FL诱导和AGM+BM诱导共6组。分别收获各组EB来源细胞,以流式细胞仪检测Sca-1+c-K it+细胞含量,并进行各系造血细胞集落形成单位(CFU)分析。结果显示:经不同基质细胞饲养层诱导后EB来源细胞中Sca-1+c-K it+细胞比例均较诱导前明显升高(p<0.01),AGM+FL诱导组为(21.96±2.54)%,显著优于其它诱导组(p<0.01),AGM+BM诱导组阳性细胞比例亦较单纯BM诱导组明显增加(p<0.01);EB对照组造血集落产率明显低于其它诱导组,AGM+FL、AGM+BM诱导组集落产率较高,尤以AGM+FL诱导组最佳(p<0.01)。结论:人AGM区基质细胞有助于维持一定的原始HSC数目及高增殖潜能,在AGM区基质细胞诱导基础上可明显提高FL或BM基质细胞对ESC源性原始HSC的进一步扩增作用。

AGM区来源的基质细胞促进造血干细胞扩增的体外实验研究

目的:探讨主动脉-性腺-中肾(aorta-gonad-mesonephros,AGM)来源的基质细胞对造血干细胞(HSC)增殖的促进作用,为探寻HSC的体外扩增方法奠定实验基础。方法:分别从孕11dBALB/c小鼠胚胎AGM区及6周龄小鼠骨髓分离、培养基质细胞,流式细胞仪等对基质细胞进行鉴定;利用小鼠胚胎干细胞(ESC)向造血细胞定向分化的模型,结合高增殖潜能集落(HPP-CFC)、原始细胞集落(BL-CFC)形成实验及流式细胞仪分析CD34+、CD34+Sca-1+细胞比例,对比研究AGM及骨髓基质细胞对ESC来源的HSC的扩增作用。结果:小鼠AGM和骨髓基质细胞在形态及表型上基本相似,均符合基质细胞的特征。AGM和骨髓基质细胞均可促进ESC来源的HPP-CFC的形成,但AGM基质细胞还可促进ESC来源的BL-CFC的形成;流式细胞仪检测发现:在骨髓基质细胞支持下,CD34+细胞增加了3-4倍,但CD34+/Sca-1+却无明显增加;而在AGM基质细胞支持下CD34+、CD34+Sca-1+细胞均明显增加了4-5倍。结论:AGM基质细胞在有效扩增小鼠HSC同时,能很好地维持HSC自我更新及多向分化的潜能。

小鼠胚胎早期血细胞发生的研究进展

根据时空上的不同,小鼠胚胎发育时期的血细胞发生目前被分为原始造血、红系/髓系祖细胞(EMPs)的产生和造血干细胞(HSCs)成熟并分化为各种血细胞3个阶段。最新的观点也把原始造血和EMPs的产生归结为非HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段,将第3阶段称为HSCs依赖性的血细胞谱系分化阶段。尽管胚胎时期的血细胞发生涉及多个造血器官,但本文中我们主要对近年在细胞和分子水平进行的造血细胞和HSCs在卵黄囊和腹主动脉-性腺-中肾(AGM)区发育的研究进行归纳总结,以此展示新近发现的胚胎发育早期血细胞发生的特点及其潜在机制。

造血干细胞联合AGM基质细胞移植对骨髓移植小鼠造血重建的影响

目的探讨造血干细胞与主动脉-性腺-中肾(Aorta-gonad-mesonephros,AGM)区来源的基质细胞联合移植对同基因骨髓移植(bone marrow transplantation,BMT)小鼠BMT后骨髓造血的影响。方法建立同基因骨髓移植小鼠模型,随机分成4组:空白对照组、BMT组、BMT联合AGM基质细胞移植组(联合移植组)及川芎嗪组,另设正常组。分别于BMT后第7、14、21、28d检测外周血细胞、骨髓单个核细胞(bone marrow mono-nuclear cells,BMMNC)、第3、7、10、14、 21、28d检测骨髓组织学变化。结果联合移植组骨髓单个核细胞较川芎嗪组恢复快,联合移植组及川芎嗪组外周血血细胞、骨髓单个核细胞、骨髓组织恢复均较单纯BMT组快,有显著性差异。结论 BMT联合AGM基质细胞移植对骨髓移植造血重建具有促进作用。

胚胎AGM区造血发育的研究现状

主动脉-性腺-中肾(AGM)区是哺乳动物体节期胚胎自主产生造血干细胞(HSC)的主要造血组织。AGM区造血发生模式主要是造血发生内皮,而近年来有证据表明造血血管原始干细胞和血管外间质也参与其造血形成。AGM-HSC的表面标志随发育成熟变化活跃,其中CD41是最早建立的造血标志,而内皮细胞特异分子在不同发育阶段HSC的表达变化提示该细胞的逐步成熟和稳定。经典造血生长因子白介素3对AGM-HSC的扩增效应令人兴奋,而联合斑马鱼模型揭示前列腺素对AGM区以及骨髓HSC的调节活性也预示今后的研究手段将更为丰富。最近,AGM区间充质干细胞(MSC)的发现及其显著的造血支持功能将有助今后发掘新型的HSC调控因子。本文就AGM区的造血发生模式、AGM区HSC的表面标志和AGM区造血干细胞的调控进行了综述。

P21基因参与早期诱导RUNX1b过表达抑制人类造血发生

目的探究细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1[CDKN1A(P21)]对造血发生过程的影响。方法对RUNX1b诱导过表达hES细胞系(RUNX1b/hESC)与小鼠主动脉-性腺-中肾区(AGM)基质细胞AGM-S3共培养4 d细胞,使用多西环素(DOX)(1μg/mL)与RepSox(0.33μmol/L)或不同浓度DOX(1、0.5、0.2、0.1μg/mL)诱导RUNX1b过表达时,以qRT-PCR技术检测P21与RUNX1b相对表达情况。利用基于转座子载体PiggyBac的PB-tet-on-OE真核诱导过表达系统,建立P21诱导过表达hES细胞系(CDKN1A/hESC)。分别在CDKN1A/hESC与AGM-S3共培养d0、d2、d4、d6添加DOX诱导P21过表达,培养8 d或14 d,通过流式细胞术(FACS)检测血细胞表面分子的变化情况,以判断诱导P21过表达对造血发生产生的影响。结果 qRT-PCR显示:P21表达量随着RUNX1b过表达上调,同时加入RepSox时表达基本处在正常水平,随着DOX浓度降低,RUNX1b与P21表达水平下降。在造血分化的早期,特别是共培养d0开始诱导P21过表达的共培养体系所产生的CD34^-CD43^+、CD34^-CD45^+与CD34^+CD45^+细胞群相较于对照分别降低了85%,94%和78%,当共培养d6后诱导P21过表达上述现象消失。结论 P21可能参与了由RUNX1b诱导过表达所引起的人类早期造血发生的抑制效应;早期诱导P21过表达明显抑制造血细胞产生。

人胚胎AGM区基质细胞在体外培养中对脐血CD34^+细胞的支持作用

目的探讨人主功脉-性腺-中肾(AGM)区基质细胞对脐血 CD34^+细胞的造血支持作用。方法采用免疫磁珠法分离人脐血 CD34^+细胞,接种于底层已制备好的人 AGM 区基质细胞 S1～S5饲养层的24孔板中,同时设无饲养层组及取自同期胚胎的躯干成纤维(hFT)细胞为对照,体外培养28 d,每7 d 收获细胞并检测总数,流式细胞术检测 CD34^+、CD34^+ CD38^-细胞含量,并行造血细胞集落培养。结果在未加外源性造血生长因子的条件下,5株人 AGM 区基质细胞 hAGMS1～S5对制造血细胞总数、CD34^+及 CD34^+CD38^-细胞、造血细胞集落均有不同程度的扩增及维持作用,与无饲养层组、hFT 细胞组比较差异有统计学意义(P<0.05)。细胞总数在21d 达到峰值[扩增(25.13±4.83)倍],CD34^+、CD34^+CD38^-细胞在扩增14 d 达到峰值[(2.68±0.51)倍、(2.38±0.45)倍],高增殖潜能集落形成单位(HPP-CFU)亦在14 d 达到峰值[(2.62±0.85)倍]。hAGMS1～S5的造血支持作用组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05),其中 hAGMS3、S4优于 S1、S2及 S5。结论人 AGM 区基质细胞对脐血 CD34^+细胞具有维持及扩增作用,特别是 hAGMS3、S4两株细胞具有更好的维持作用。