沉默FOXO1基因对人主动脉血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨叉头框转录因子O1(FOXO1)基因对腹主动脉瘤(AAA)血管平滑肌细胞自噬和凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法:收集19例AAA患者动脉瘤组织(AAA组)及邻近正常主动脉组织(对照组),采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平,透射电镜观察2组研究对象动脉瘤组织中自噬溶酶体形成情况;Western blotting法检测2组研究对象动脉瘤组织中FOXO1及自噬相关蛋白卷曲螺旋肌球蛋白样B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)结合蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白1轻链3α(LC3)和P62蛋白表达水平。体外培养人主动脉血管平滑肌细胞(hVSMCs),并采用FOXO1 siRNA(si-FOXO1)及其阴性对照(si-NC)慢病毒感染hVSMCs,10μmol·L^(-1)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)联合自噬激活剂雷帕霉素(Rap)进行干预,将细胞分为空白对照组、AngⅡ组、AngⅡ+si-NC组、AngⅡ+si-FOXO1组、AngⅡ+si-NC+Rap组和AngⅡ+si-FOXO1+Rap组。CCK-8法检测各组细胞增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡水平,ELISA法检测各组细胞上清中基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)水平,RT-qPCR法检测各组细胞中FOXO1 mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中FOXO1、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)、Beclin1、LC3和P62蛋白表达水平。结果:与对照组比较,AAA组动脉瘤组织中FOXO1 mRNA表达水平升高(P<0.05),自噬溶酶体数量增多(P<0.05),Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),P62蛋白表达水平降低(P<0.05)。与空白对照组比较,AngⅡ组hVSMCs增殖活性降低(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平降低(P<0.05);与AngⅡ+si-NC组比较,AngⅡ+si-FOXO1组hVSMCs增殖活性升高(P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平降低(P<0.05),细胞中Bax、Cleaved-caspase-3和Beclin1蛋白表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),Bcl-2和P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。与AngⅡ+si-FOXO1组比较,AngⅡ+si-FOXO1+Rap组细胞凋亡率升高(P<0.05),细胞上清中MMP-2和MMP-9水平升高(P<0.05),细胞中Beclin1蛋白表达水平和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05),P62蛋白表达水平升高(P<0.05)。结论:FOXO1基因沉默可能通过降低自噬水平来提高AngⅡ暴露下hVSMCs增殖活性,并抑制其凋亡,从而参与AAA的发病。

人主动脉血管平滑肌细胞铁死亡模型的建立

目的在人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMCs)中建立铁死亡模型并进行验证。方法主动脉平滑肌细胞来源于在华中科技大学同济医学院附属同济医院心脏大血管外科行心脏移植手术的供体主动脉弓组织,分别使用含Imidazole ketoneerastin(IKE)和胱氨酸缺失(CD)的培养液对HAVSMCs进行铁死亡诱导,并使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、人乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒、细胞流式检测及免疫荧光染色来判断平滑肌细胞的铁死亡模型是否建立成功。结果对HAVSMCs进行铁死亡诱导后,光学显微镜下可观察到细胞出现明显形态学改变,流式细胞学分析显示IKE/CD诱导下碘化丙啶(PI)染色阳性细胞所占比例明显升高;CCK-8和LDH检测结果显示,在IKE/CD诱导下HAVSMCs细胞活力明显降低,细胞损伤率明显增加,而铁死亡抑制剂ferrostatin-1则能逆转铁死亡诱导对细胞的毒性作用;BODIPY-C11细胞流式分析及4-羟基壬烯醛(4-HNE)免疫荧光染色显示,IKE/CD诱导的HAVSMCs中脂质过氧化水平明显上升。结论该研究使用IKE以及胱氨酸缺失培养液成功建立了人主动脉血管平滑肌细胞铁死亡模型,为后续研究提供了实验基础。

DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 明确DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HVSMC)钙化过程中的作用。方法 将HVSMC培养分为对照组、模型组、共济失调毛细血管扩张突变激酶(iATM)组、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(iPARP)组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测4组细胞钙化情况,彗星实验检测DNA损伤,Western blotting和免疫荧光方法检测组蛋白γH2AX磷酸化水平,酶联免疫吸附试验检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,NucleoCounterNC-3000^(TM)高级细胞分析仪分析4组细胞的存活率。结果 光学显微镜和茜素红S染色发现第9天开始,与对照组相比,模型组出现细胞内钙质沉积,第12天钙质沉积明显。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下Ca^(2+)/蛋白比较,结果:(1)不同时间点Ca^(2+)/蛋白有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组Ca^(2+)/蛋白有差异(F=203.040,P=0.000),模型组Ca^(2+)/蛋白较高,钙化明显;(3)两组Ca^(2+)/蛋白变化趋势有差异(F=13.213,P=0.000)。培养12 d时,茜素红S染色发现模型组比对照组钙化程度高,iATM组和iPARP组比模型组钙化程度低。σ-甲酚酞试验发现,iATM组和iPARP组Ca^(2+)/蛋白低于模型组(P <0.05)。彗星试验发现,对照组比较,模型组第9天开始出现更多数量的DNA受损细胞。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下“彗星细胞”比较,结果:(1)不同时间点“彗星细胞”有差异(F=13.141,P=0.000);(2)模型组与对照组“彗星细胞”有差异(F=121.521,P=0.000),模型组“彗星细胞”百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组“彗星细胞”变化趋势有差异(F=89.290,P=0.000)。模型组γH2AX蛋白相对表达量高于对照组(P <0.05)。对照组、模型组分别在第3和12天免疫荧光显微镜下观察> 3个γH2AX病灶百分比,结果:(1)不同时间点> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=203.040,P=0.000),模型组> 3个γH2AX病灶百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比变化趋势有差异(F=153.410,P=0.000)。模型组8-OHDG水平高于对照组(P <0.05)。模型组细胞存活率低于对照组、iATM组、iPARP组(P <0.05);iATM组、iPARP组与对照组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高Ca^(2+)/P环境激活DNA损伤应答信号通路,诱导HVSMC坏死,进而形成钙化。

高盐干预对人主动脉血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响

目的:研究不同浓度Na+干预对人主动脉血管平滑肌细胞(HAVSMC)增殖和迁移的影响。方法:原代培养HAVSMC,传代至第5代后用不同浓度的Na+(132、137、142、147、152、157、162、167 mmol/L)干预,培养24、48、72、96 h后进行细胞增殖和迁移实验。CCK-8法检测HAVSMC的增殖活性;实时荧光定量聚合酶链反应检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达,分析HAVSMC的增殖能力;划痕实验评估HAVSMC的迁移能力。结果:与132 mmol/L Na+对照组相比,培养72 h后,137~167 mmol/L Na+干预均可促进HAVSMC的增殖能力(P<0.05),Na+浓度为152 mmol/L时具有显著的促增殖作用(P<0.05),且可促进HAVSMC的迁移。结论:高盐干预可促进HAVSMC增殖和迁移。

组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞的特征

目的:采用组织块贴壁法培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞,并应用光镜、电镜和免疫组织化学方法观察细胞各生长时期的形态变化。方法:实验于2004-02/08在中国医科大学基础医学院药理实验室完成。选择健康清洁级Wistar大鼠30只,体质量150～180g,无菌条件下取全段主动脉中膜组织修剪成1mm×1mm大小的组织块直接贴壁于一次性塑料培养皿中,组织块间距0.5cm,保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀,发现漂起的组织块及时清理,于37℃孵箱内放置1.5h左右使组织块与壁贴附后,缓慢加入改良Eagle培养液培养3～5d,待有细胞从组织块周围游出后换液。当细胞长满培养皿时即可传代。采用倒置相差显微镜和透射电镜及抗α-平滑肌肌动蛋白免疫组织化学方法观察主动脉平滑肌细胞的形态。绘制主动脉平滑肌细胞生长曲线,观察各生长时期的变化,并评估其培养方法的优点。结果:30只大鼠全部进入结果分析。①技术方法优点:贴块方便,直接一次性贴壁使污染机会少,随组织块生长随时清理漂起的组织块,可减少对其他组织块的毒性作用,并增加已游离出的细胞生长空间。②原代培养血管平滑肌细胞:光镜观察形态多样,大小略有差异,胞体较小,胞质折光性强。③传代血管平滑肌细胞:光镜下观察呈现特征性“峰”、“谷”状生长。电镜下观察:细胞形态不规则,胞浆内有肌丝,纵向平行排列,有密区,具备平滑肌细胞特征。免疫组织化学染色后可见细胞浆中大量平行条状棕黄染色、胞核不着色,所有细胞均染色,呈阳性。④主动脉平滑肌细胞生长曲线:血管平滑肌细胞生长曲线近似“S”形,传代后第1天细胞数有所减少,经过2d潜伏适应期后进入对数生长期,持续两三天进入平台期。结论:组织块贴壁法培养技术具有操作简便,污染机会少,有足够细胞生长空间的优点,经光镜和电镜观察培养出新的主动脉血管平滑肌细胞具有平滑肌细胞特征,免疫组织化学染色也显示所有细胞均呈阳性。传代培养后第2天进入对数生长期,持续两三天进入平台期,可产生纯度高及数量多的平滑肌细胞。

高脂血清对人主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响及其机制

目的观察高脂血清对人主动脉血管平滑肌细胞(HASMC)增殖的影响,并探讨其机制。方法取对数生长期HASMC细胞分为实验组和和对照组,实验组包括实验1、2、3组,另设空白对照组。对照组常规培养;实验1、2、3组分别加入10%、15%、20%浓度的高脂血清培养;空白对照组仅加培养基无细胞。继续培养6、12、24、48 h,用CCK-8法测算实验组HASMC细胞增殖率;培养24 h时采用实时荧光定量PCR法检测各组HASMC中GRIM-19和p-STAT3 mRNA,采用Western blotting法检测GRIM-19和p-STAT3蛋白。结果相同时间点细胞增殖率实验3组高于实验2组,实验2组高于实验1组,P均<0.05。随着高脂血清培养时间增加,各组HASMC细胞增殖率呈递增趋势,P均<0.05。培养24 h时HASMC中GRIM-19 mRNA和蛋白实验3组低于实验2组,实验2组低于实验1组,P均<0.05;HASMC中p-STAT3 mRNA和蛋白实验3组高于实验2组,实验2组高于实验1组,P均<0.05。结论高脂血清可以促进HASMC增殖。与10%、15%的高脂血清相比,20%高脂血清促进HASMC增殖的效果最为明显。其作用机制可能与GRIM-19下调p-STAT3表达有关。

促炎因子介导的体外培养人主动脉血管平滑肌细胞凋亡

目的 :探讨促炎因子对体外培养的人主动脉平滑肌细胞有无致凋亡作用。 方法 :体外原代培养人主动脉平滑肌细胞 ,用免疫组化方法鉴定 ;肿瘤坏死因子 α (TNF α)和白细胞介素 1β (IL 1β)分别以浓度 2 0 μg/ml单独或二者共同与平滑肌细胞培养 3 6h ,实验分 4组 :TNF α组 (T组 )、IL 1β组 (I组 )、TNF α+IL 1β组 (TI组 )及对照组 ,采用流式细胞仪分析细胞凋亡及细胞周期。 结果 :①细胞凋亡分析显示 :TI组两种因子的联合作用诱导人平滑肌细胞凋亡与对照组比明显增加 ,有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,而二者单独作用未能诱导人平滑肌细胞凋亡。②细胞周期分析发现TI组在TNF α +IL 1β刺激下 ,细胞增殖能力与其他组比有明显下降 ,有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,生长逐渐停滞 ,而二者单独作用对细胞增殖有轻微刺激作用 ,但与对照组无显著性差异。 结论 :促炎因子TNF α和IL 1β的相互作用 ,可以诱导人平滑肌细胞凋亡。

三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：研究三油酸甘油酯对大鼠主动脉血管平滑肌细胞（rat aortic smooth muscle cells,RASMC）增殖的影响。方法：采用体外细胞培养、油红染色观察细胞形态的变化;MTT法、流式细胞术检测三油酸甘油酯对RASMC增殖的影响。结果：油红染色结果显示三油酸甘油酯使RASMC失去原来长梭形外观,胞体变大;三油酸甘油酯浓度越高变化越明显,2 000 mg/dl已无正常细胞存在。三油酸甘油酯对RASMC增殖的影响与作用时间及三油酸甘油酯的浓度密切相关。在24 h≤125 mg/dl,表现为抑制增殖作用;24 h≥250 mg/dl及48～72 h≤500 mg/dl,表现为促进增殖作用,其中24 h,1 000 mg/dl时增殖率最大约为115.9%,与对照组相比差异有统计学意义（t=-3.74,P=0.002）;48～72 h〉500 mg/dl及96～144 h,62.5～2 000 mg/dl表现为抑制增殖作用,其中,48、72 h这2个时间点在2 000 mg/dl的增殖率分别较对照组下降42.7%（t=13.08,P=0.000）和65%（t=129.53,P=0.000）,与对照组相比差异有统计学意义。流式周期结果表明,三油酸甘油酯组G0/G1期的百分比较对照组降低,而S期百分比增高。流式凋亡结果为,除了24 h和144 h外,其余各时间点的凋亡率较对照组降低,其中72 h及120 h的凋亡率分别为1.1%（F=14.39,P=0.019）,0.7%（F=9.96,P=0.034）,与对照组相比差异有统计学意义。另外,细胞增殖与凋亡的变化方向一致。结论：三油酸甘油酯对RASMC增殖的影响是双向的,即在低浓度短时间及高浓度长时间的抑制增殖作用,在中间合适的浓度及时间表现为促进增殖作用;细胞增殖周期试验结果也支持三油酸甘油酯具有一定的促进或抑制大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖作用;高浓度脂质对细胞的直接毒性作用、诱导细胞的增殖或凋亡作用,可能共同参与调控血管平滑肌细胞的数目及功能。

myocardin通过激活miR-93-5p促进人主动脉血管平滑肌细胞分化

myocardin是促进平滑肌细胞分化的重要转录因子.微小RNA(microRNAs,miRNA)在近年来已经证实参与多种生物学过程,包括平滑肌的表型转化.然而在平滑肌分化过程中myocardin与哪些microRNA具有相关性仍有待于阐明.通过将外源性myocardin转入人主动脉血管平滑肌细胞(human aortal vascular smooth muscle cells,HA-VSMCs)中,利用免疫印迹(Western blot)检测分化标志基因肌动蛋白α2(actin alpha2,ACTA2)和肌动蛋白相关蛋白(smooth muscle 22 alpha,SM22α)的表达;利用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测过表达或敲低myocardin对miR-93-5p水平的影响;构建miR-93-5p启动子的荧光素酶报告质粒,利用荧光素酶报告分析证实myocardin对mi R-93-5p启动子的转录激活作用.上述结果证实myocardin可能通过激活miR-93-5p的转录,上调其表达,进而促进血管平滑肌细胞的分化.

透明质酸对游离脂肪酸引起的人主动脉血管平滑肌细胞表达IL-6、IL-8和TNF-α的影响

目的探讨透明质酸(HA)对游离脂肪酸(FFA)引起的人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMC)表达白细胞介素6(IL-6)、IL-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法培养HA-VSMC,用不同浓度(0、100、200、400μmol/L)FFA和不同浓度FFA+高分子量HA(HMW-HA)或低分子量HA(LMW-HA)处理细胞24、48 h。噻唑蓝法检测FFA和FFA+HA对HA-VSMC存活率的影响;Ed U染色检测细胞增殖活性;酶联免疫吸附法检测培养上清IL-6、IL-8和TNF-α含量;实时荧光定量PCR和Western blot检测IL-6、IL-8和TNF-αmRNA及蛋白表达水平。结果(1)FFA在400μmol/L内呈浓度依赖性诱导HA-VSMC增殖;(2)HMW-HA、LMW-HA均对FFA诱导的HA-VSMC增殖有抑制作用,且HMW-HA抑制作用强于LMW-HA;(3)FFA显著促进HA-VSMC IL-6、IL-8和TNF-α的分泌,且有明显的时间和浓度依耐性;HA可以抑制上述作用;(4)实时荧光定量PCR和Western blot结果显示,FFA+HMWHA组、FFA+LMW-HA组IL-6、IL-8、TNF-αmRNA及蛋白表达水平均低于FFA组(均P<0.01),其中FFA+HMW-HA组又低于FFA+LMW-HA组(P<0.01)。结论 (1)FFA诱导HA-VSMC IL-6、IL-8、TNF-αmRNA和蛋白表达升高;(2)HA对FFA引起的HA-VSMC IL-6、IL-8和TNF-α的表达有抑制作用,且HMW-HA抑制效果强于LMW-HA。

小鼠主动脉血管平滑肌细胞分离培养及鉴定

目的建立体外分离培养小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的技术方法并观察其生长特征。方法比较组织贴块法及酶联合消化法原代分离小鼠主动脉来源的VSMC,利用倒置显微镜观察细胞生长情况;苏木精-伊红(HE)染色观察细胞形态及免疫荧光染色法鉴定细胞;台盼蓝法、绘制生长曲线法、3-(4,5-二甲基-2-噻唑)-2,5-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法分别测定主动脉VSMC传代细胞的成活率、生长、增殖特征;观察不同血清含量对主动脉VSMC生长的影响。结果组织贴块法培养的细胞6 d后,细胞从组织块边缘长出,14 d后生长迅速可传代;酶联合消化法分离培养的细胞3 d后,细胞呈梭形生长,7～8 d后生长迅速可传代;第2代细胞在显微镜下观察可见呈典型"峰-谷"状生长;2种方法获得的细胞行免疫荧光染色显示胞浆内α-平滑肌肌动蛋白表达阳性,细胞成活率均为96%;细胞生长曲线近似"S"形,MTT法显示细胞生长第3～5天光密度值变化较明显;用含体积分数20%血清的杜尔伯科改良伊格尔培养基高糖培养液培养的细胞出现明显对数期。结论本研究建立了高效分离和培养主动脉VSMC的2种方法,细胞均稳定地表达α-平滑肌肌动蛋白,为血管疾病的研究提供了理想的细胞模型。

成人主动脉血管平滑肌细胞的体外培养

目的:建立成人主动脉血管平滑肌细胞的体外培养方法:方法:无菌条件下分离出成人胸主动脉的平滑肌层,剪成1 mm×1 mm×1 mm的碎片,用组织块贴壁法,以含胎牛血清的DMEM培养基进行培养,牛长融合的细胞用0.25%的胰酶消化、传代。观察培养细胞的形态学特点,并用免疫荧光的方法检测血管平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)的表达。结果:在贴壁培养10～12天后,组织块的边缘开始有少量细胞爬出,呈长梭形,胞浆透亮、丰富:继续培养1～2周后组织块边缘融合,呈典型的"峰谷"样表现。消化传至3～8代,细胞的生长特性未见明显改变,免疫荧光显示细胞α-SMA的表达丰富。结论:组织块贴壁法培养人主动脉血管平滑肌细胞是一种稳定、可行的实验方法。

普罗托品对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内游离钙浓度和蛋白激酶C活性的影响(英文)

本实验室先前的研究已证实,普罗托品(protopine,Pro)舒张家兔主动脉的作用,可能与其增加血管平滑肌细胞内cAMP和cGMP水平有关。为了深入探讨Pro的扩血管作用机制,实验采用等张收缩记录大鼠离体血管条张力,利用Fura-2/ AM负载的大鼠胸主动脉培养细胞直接测定细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i),并应用同位素γ-32P-ATP催化活性法测定蛋白激酶C (PKC)活性等方法,分别观察了Pro的相关效应。结果表明,Pro(30和100μmol/L)明显降低去甲肾上腺素(NA)和高钾所致的动脉条收缩幅度,使二者的量效曲线呈非平行右移,最大反应压低;pD21值分别为3.7±0.25和3.97±0.15;Pro(50和100 μmol/L)对静息状态下的[Ca2+]没有任何影响,但对NA和高钾引起的[Ca2+]i升高均有明显抑制作用;Pro(30和100 μmol/L);对未经NA处理血管条的胞浆和胞膜PKC活性均无明显影响:但在NA预处理的血管条,Pro使NA所升高的胞浆内PKC的活性趋于降低,而明显升高胞膜PKC的活性,对PKC的总活性无明显影响。结果提示,在有NA存在的情况下,Pro似能促使PKC从胞浆向细胞膜转移,其扩血管效应似为其降Ca2+作用、升高cAMP和cGMP的作用及其对PKC影响等几方面的综合结果。

全反式维甲酸对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞增殖及细胞周期素E表达的影响

目的 研究全反式维甲酸 (ATRA)对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及细胞周期素E(Cy clinE)蛋白表达水平的影响。方法 血管平滑肌细胞采用组织贴块法培养。ATRA(2 .5× 10 - 6 mol·L- 1 )作用于经 2 0 %胎牛血清刺激后的VSMC ,2 4h后分别行3H TdR掺入实验测定和蛋白印迹检测CyclinE蛋白表达。 结果 ATRA明显抑制ATRA的DNA合成 (P <0 .0 1)和CyclinE蛋白的表达 (P <0 .0 5 )。结论 ATRA抑制CyclinE蛋白的表达是抑制VSMC增殖的原因之一。

全反式维甲酸对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞增生及P21表达的影响

目的 探讨全反式维甲酸 (ATRA)对培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞增生及P2 1蛋白表达水平的影响。方法 血管平滑肌细胞 (VSMC)采用组织贴块法培养。ATRA(2 .5×10 -6mol·L-1)作用于经 2 0 %胎牛血清刺激后的血管平滑肌细胞 ,2 4h后分别行 3H TdR掺入实验测定和P2 1蛋白印迹检测P2 1蛋白表达。结果 ATRA明显抑制血管平滑肌细胞DNA合成和促进P2 1蛋白表达。结论 ATRA促进P2

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和鉴定

目的探讨大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的原代培养方法,了解生长特性,为血管增生性疾病的治疗研究提供试验材料。方法采用组织贴块法培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,用倒置相差显微镜观察其生长情况,用免疫组化染色做鉴定,台盼蓝染色进行活力检测。结果85%的组织块接种存活,原代培养后2周左右即可传代,至少可以传8代以上,并且细胞形态、生长特点不发生明显的改变,6代的血管平滑肌细胞纯度达97%以上。台盼蓝染色约有94%以上的细胞为活细胞。镜下培养的血管平滑肌细胞呈典型的"谷峰状"生长,免疫组化染色显示胞浆内α平滑肌肌动蛋白阳性表达。结论正确地利用组织贴块法可以简单、经济、高效地培养出血管平滑肌细胞,为血管增生性疾病的治疗研究提供了理想的细胞模型。

大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养方法的改进

目的:探索提高大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)原代培养效率和纯度的方法。方法:在原有组织贴块法培育大鼠原代VSMCs的基础上进行改良,分离出胸主动脉后进一步分离中膜,DMEM高糖培养基中加入10μg/L血小板源性生长因子B(PDGF-B)。用细胞形态学及细胞免疫荧光对VSMCs进行鉴定。结果:6 d左右组织块周围有细胞爬出,12 d左右可以传代。镜下见细胞呈梭形,典型"峰谷"状排列生长;免疫荧光鉴定可见大量平滑肌肌动蛋白(SMA),比传统方法获得的细胞纯度高。结论:加入PDGF-B可以缩短大鼠VSMCs原代培养时间,提高效率;剥离中膜可以提高大鼠VSMCs原代细胞的纯度。

重组人白介素10对离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察重组人白介素１０（ｒｈＩＬ－１０）对血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）增殖的影响。方法 离体培养大鼠胸主动脉 ＶＳＭＣ并分别接受不同浓度ｒｈＩＬ－１０、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ－α）、血小板源性生长因子（ＰＤＧＦ－ＢＢ）的刺激，采用ＭＴＳ／ＰＥＳ 法确定ＶＳＭＣ的增殖状态并与对照组比较。结果 与对照组相比，ＴＮＦ－α和ＰＤＧＦ－ＢＢ均对ＶＳＭＣ增殖具有明显的刺 激作用（Ｐ＜０．０５）。单独应用ｒｈＩＬ－１０对血管平滑肌细胞生长没有影响。在ＴＮＦ－α和ＰＤＧＦ－ＢＢ分别刺激下，ｒｈＩＬ－１０均可 抑制ＶＳＭＣ的生长（Ｐ<０．０５）。结论 ｒｈＩＬ－１０可抑制细胞因子和生长因子诱导的ＶＳＭＣ增殖。

槲皮素对家兔主动脉血管平滑肌细胞胞内游离钙浓度的影响

目的：探讨槲皮素（Ｑｕｅ）对血管平滑肌细胞胞内游离钙浓度（［Ｃａ^（２＋）］ｉ）的影响。方法：采用新一代钙荧光探剂 Ｆｌｕｏ－３／ＡＭ检测 Ｑｕｅ对培养的兔主动脉血管平滑肌细胞（ＡＳＭＣ）［Ｃａ^（２＋）］ｉ在高Ｋ~＋、去甲肾上腺素（ＮＥ）、血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）刺激作用下的改变，并与Ｖｅｒａｐａｍｉｌ进行对照研究。结果：Ｑｕｅ（１０^（－６）、１０^（－５）、１０^（－４）ｍｏｌ／１）呈剂量依赖性抑制高Ｋ~＋去极化引起的［Ｃａ^（２＋）］ｉ升高，与Ｖｅｒａｐａｍｉｌ作用相似，但弱于Ｖｅ－ｒａｐａｍｉｌ；Ｑｕｅ（１０^（－６）～１０^（－４）ｍｏｌ／Ｌ）对ＮＥ，ＡｎｇⅡ通过受体介导引起的［Ｃａ^（２＋）］ｉ增高也具有明显的抑制作用。但Ｑｕｅ对静息状态的ＡＳＭＣ［Ｃａ^（２＋）］ｉ无明显影响。结论：Ｑｕｅ通过对血管平滑肌细胞电压依赖性钙通道和受体操纵性钙通道双重抑制作用，降低细胞内游离钙水平，这可能是其舒血管降压机制之一。