黄酮类化合物抑制新型冠状病毒主蛋白酶的研究

目的探讨部分黄酮类化合物对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制作用。方法以奈玛特韦为阳性对照化合物,利用主蛋白酶荧光偏振法筛选模型检验黄酮类化合物橙皮素、木犀草素、染料木素、毛蕊异黄酮、芹菜素、根皮素、芹菜素-7-葡萄糖苷、染料木苷、染料木素-4'-葡萄糖苷和橙皮苷对于新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。结果阳性对照物奈玛特韦在100、50、25μmol/L浓度对于主蛋白酶的抑制率分别为91%、76%和70%,而黄酮类化合物橙皮素、木犀草素、染料木素、毛蕊异黄酮、芹菜素、根皮素、芹菜素-7-葡萄糖苷、染料木苷、染料木素-4'-葡萄糖苷和橙皮苷在对应药物浓度均未表现出对主蛋白酶的有效抑制活性。结论上述黄酮类化合物在细胞水平具有抗新型冠状病毒的药理活性,其作用机理极可能为抑制新型冠状病毒RNA聚合酶,而并非抑制主蛋白酶,实验数据可为后续抗新型冠状病毒药物的研发提供思路和参考。

新型冠状病毒主蛋白酶及其抑制剂研究进展

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引起的传染性疾病,而主蛋白酶具有高度的序列保守性,在冠状病毒生命周期中起关键作用,是理想的抗病毒药物设计靶标。本文概述了SARS-CoV-2主蛋白酶的结构和催化反应机制,并根据主蛋白酶抑制剂结构和机制的不同,将已报道的抑制剂分为肽模拟抑制剂和非肽类小分子抑制剂两类,其中以Paxlovid为代表的肽模拟抑制剂,根据其基团可分为基于金属络合物类的Ebselen,基于亚硫酸氢盐类的GC376与GC373,基于醛类的钙蛋白酶抑制剂Ⅱ、Ⅻ和α酮酰胺类的化合物13a、13b。此外,非肽类小分子药物黄芩素也极具潜力。最后对主蛋白酶抑制剂的抗病毒活性、耐药性、稳定性和广谱性等进展进行综述,为广谱抗病毒药物的研发提供参考。

桑辛素对新型冠状病毒主蛋白酶抑制作用的研究

目的 探讨桑辛素对新型冠状病毒主蛋白酶的抑制作用。方法 利用软件AutoDock将桑辛素与主蛋白酶晶体结构6LU7的活性位点进行分子对接;而后利用主蛋白酶荧光偏振筛选模型检验桑辛素对于新型冠状病毒主蛋白酶的抑制活性。结果 桑辛素与主蛋白酶活性位点具有较强的分子间相互作用,分子对接过程释放的自由能为-8.3 kcal/mol;在药理活性测试中,桑辛素在400、200、100、25μmol/L浓度对主蛋白酶的抑制率分别为45%、34%、8%、1%。结论 实验表明,桑辛素具有一定的主蛋白酶抑制活性。与既往报道的小分子黄酮类化合物相比,桑辛素对主蛋白酶的抑制活性明显增强,其原因可能为黄酮母核引入了脂溶性取代基进而增强了其与主蛋白酶活性位点处的结合能力相关,为黄酮母核类主蛋白酶抑制剂的结构优化提供参考。

新型冠状病毒主蛋白酶天然产物抑制剂的筛选

为寻找新型冠状病毒主蛋白酶天然产物抑制剂,本文以SARS-CoV-2主蛋白酶为研究对象,通过计算机辅助药物筛选方法初步筛选出16个潜在抑制剂并进行体外酶活测试.其中,野黄岑素对SARS-CoV-2主蛋白酶的IC_(50)为(10.79±2.116)μmol/L,没食子儿茶素没食子酸酯抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的IC_(50)为(2.104±0.346)μmol/L.最后,将两种天然产物与主蛋白酶进行分子动力学模拟发现没食子儿茶素没食子酸酯和野黄岑素与新型冠状病毒主蛋白酶结合时的复合物RMSD都在0.22附近,说明两个天然产物与新型冠状病毒主蛋白酶结合较为稳定,可以作为新型冠状病毒主蛋白酶的抑制剂或先导化合物.

TCMSP数据库中药化学成分的SARS-CoV-2主蛋白酶抑制剂虚拟筛选

目的运用计算机模拟技术从中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)的中药化学成分中挖掘SARS-CoV-2主蛋白酶(Main protease,Mpro)抑制剂。方法运用类药性评估、分子对接、ADME预测、结合自由能计算、分子动力学模拟等多轮虚拟筛选的策略,从TCMSP数据库中筛选Mpro抑制剂。结果共筛选得到10个命中分子,其中前3位最佳命中分子为MOL003392、MOL011716、MOL002966,表现出与靶标活性口袋关键氨基酸残基的强相互作用。结论该研究可为发现SARS-CoV-2 Mpro小分子抑制剂提供新的思路。

胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白制备血管紧张素转化酶抑制肽工艺的优化

采用胃-胰蛋白酶水解蜂王浆主蛋白(MRJPs),对底物浓度、pH值、酶作用时间和蛋白酶浓度对水解效果的影响进行单因素分析,然后通过正交试验对胃-胰蛋白酶共同作用的酶解工艺进行优化;最后采用超滤分离技术对王浆主蛋白水解产物(H-MRJPs)进行分离,以制备血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽。结果表明:优化的酶解工艺为37℃恒温、质量比为1%的胃蛋白酶(pH=2.0)和胰蛋白酶(pH=7.5)各水解2h;在最佳工艺条件下,MRJPs水解度为28.7%,总氮回收率为35.5%;通过SDS-PAGE电泳未检测到MRJPs水解产物(H-MRJPs)含有明显的蛋白条带;采用超滤法对H-MRJPs分离得到分子质量范围为<1、1～5和>5ku的3类血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽,其ACE半抑制质量浓度(IC50)分别为0.33、0.61和1.09mg.mL-1,即以分子质量<1ku的产物活性最强。该结果为利用王浆主蛋白开发降压功能食品提供了科学依据。

冠状病毒主蛋白酶及其化学抑制剂研究进展

一个新的冠状病毒已经被鉴定为急性呼吸道综合症(SARS)的病原体,控制该病毒复制复合体活性的主蛋白酶(Mpro或3CLpro)将很可能成为开发针对SARS特效治疗药物的靶位点。综述了人冠状病毒株229E(HCoV229E)和一种在猪体内引发传染性胃肠炎的病毒(TGEV)的Mpro的晶体结构以及以此为基础构建的SARS冠状病毒(SARS-CoV)同源蛋白酶的空间结构模型。通过对这些同源蛋白酶的结构及其与已知的蛋白酶化学抑制剂的结合特征进行分析后发现Mpro的底物结合位点具有惊人的保守性,这种保守性也被重组SARS-CoVMpro能介导的TGEVMpro的底物剪切实验所进一步证实。分子模型表明已有的鼻病毒3Cpro抑制剂经过改进后或许能用于SARS的治疗。

基于生物信息学与分子结构的SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS CoV M^(pro))多肽类抑制剂研究

用冠状病毒基因解析软件系统ZCURVE_CoV 2.0,从SARS冠状病毒(TOR2,NC_004718)的RNA基因序列出发,搜索出含有SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS CoV Mpro)真实剪切位点的11个八肽,运用分子叠合和分子对接的方法,对11个八肽进行了分析,证明这11个八肽有相似的活性,而且11个八肽中,op4的活性最高.分析认为,op4有望成为抗SARS药物的理想前体.

SARS冠状病毒主蛋白酶可切割多肽的搜索与生物信息学的应用

用新近发展的冠状病毒的基因解析软件系统ZCURVE -CoV 1 .0和ZCURVE -CoV 2 .0(http ://tubic .tju .edu .cn/sars/)分析了基因库 (NCBIRefSeqproject)中的 2 7个不同来源的SARS冠状病毒的RNA基因序列 ,找出了主蛋白酶 (CoVMpro)在聚蛋白pp1a和pp1ab中的 2 97个酶切位点 .在此基础上确定的 1 1个SARS冠状病毒主蛋白酶的可切割八肽 .这些八肽都含有SARSCoVMpro 的真实切割点 ,因而是发展SARSCoVMpro的多肽类抑制剂的适宜出发点 .计算了可切割八肽在特异性位点R2、R1、和R1上的氨基酸的分布概率 ,发现位点R4和R3也有一定的特异性 .分析了这些位点上的氨基酸的结构特征 ,找出了最有希望成为SARSCoVMpro的多肽类抑制剂的两个八肽NH2 -ATLQ↓AIAS-COOH和NH2 -ATLQ↓AENV -COOH ,并探讨了对可切割八肽作化学修饰的思路 ,为SARSCoVMpro的多肽类抑制剂和非肽类抑制剂的设计提供了基础 .同时把生物信息学用于药物开发 。

大鼠抗新冠病毒主蛋白酶多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达与分离纯化新冠病毒主蛋白酶(Mpro)并制备大鼠抗Mpro多克隆抗体用于研究Mpro在2019冠状病毒病(COVID-19)中的免疫学功能。方法将密码子优化的新冠病毒Mpro基因连接到pET-28a载体中,构建重组质粒pET-28a-Mpro。再将其转化到E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,经原核表达条件优化后,以亲和层析法分离纯化Mpro。将纯化的Mpro作为抗原免疫大鼠,制备抗Mpro多克隆抗体。以ELISA和Western blot实验鉴定抗Mpro多克隆抗体的效价、抗原特异性与灵敏性。结果利用大肠杆菌原核表达技术,确定了Mpro的最佳表达条件并成功进行了分离纯化。ELISA与Western blot实验结果证实,制备的抗Mpro多克隆抗体效价可达1∶256000,且具有良好的抗原特异性与灵敏性。结论成功制备了高特异性大鼠抗Mpro多克隆抗体,为研究Mpro在COVID-19中的免疫学功能奠定了实验基础。

基于新型冠状病毒SARS-CoV-2主蛋白酶结构的小分子抑制剂虚拟筛选

通过使用分子对接与虚拟筛选技术,以SARS-CoV-2主蛋白酶(Main Protease,Mpro)为靶点,利用Autodock Vina软件和Python脚本进行分子对接,结合小分子的对接评分与结合模式分析,筛选出特异性作用于主蛋白酶的小分子抑制剂。结果发现,以SARS-CoV-2主蛋白酶原配体N3为对照,Reactive blue 2等分子具有更好的对接打分与合理的结合模式,或可成为潜在的主蛋白酶小分子抑制剂,可为寻找抗新冠病毒治疗药物提供线索。

土壤脱氢酶与蛋白酶对酞酸酯污染的动态响应

为评价农田土壤酞酸酯(Phthalate acid esters,PAEs)污染的生态风险,采用室内模拟法,在土壤受邻苯二甲酸二(乙基-己基)酯[Dis(2-ehylhexyl)phthalate ester,DEHP]和邻苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate ester,DBP)2种酞酸酯类化合物单一和复合不同污染水平下,测定土壤脱氢酶与蛋白酶活性在培养期内对这2种化合物单一污染与复合污染的动态变化。结果表明:土壤中浓度小于10 mg/kg的DBP和浓度小于20 mg/kg的DEHP对土壤脱氢酶与蛋白酶活性没有明显影响,浓度为20 mg/kg时DBP对土壤脱氢酶表现出抑制-激活-恢复效应;在DBP浓度为20 mg/kg时土壤蛋白酶短期内有明显的激活效应;当土壤中DBP或DEHP污染浓度大于或等于50mg/kg时,土壤蛋白酶与土壤脱氢酶均被显著抑制;DBP与DEHP复合污染对土壤脱氢酶表现出协同抑制效应,而对蛋白酶没有类似的效应特征,主成分分析(PAC)也佐证了以上结果。因此,土壤脱氢酶与蛋白酶可以作为土壤酞酸酯污染生态风险评价的生物学指标,但对酞酸酯不同污染水平,这两种土壤酶活性的响应特征有所差异。

新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A_1与RFP-B_1基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达,并以HisTrap~(TM)层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示,荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。

冠状病毒主蛋白酶小分子有机硒化合物抑制剂筛选

[目的]基于荧光共振能量转移技术(FRET)筛选抑制冠状病毒主蛋白酶(M^(pro))活性的小分子有机硒化合物。[方法]将两种冠状病毒M^(pro)蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中表达并纯化;基于FRET确认M^(pro)蛋白的体外活性并对13种小分子有机硒化合物进行筛选;进一步用MTT法测定有效化合物的细胞毒性;最后利用计算机软件AutoDock 4.2.6对有效化合物和两种冠状病毒M^(pro)进行分子对接分析。[结果]成功表达纯化出具有酶活性的两种M^(pro)蛋白;筛选发现11种化合物对两种M^(pro)均具有抑制效果,其中SLL-1A-46的抑制效果最显著,其对两种M^(pro)的酶活半抑制浓度(IC_(50))分别为:23.95μmol/L(MERS-CoV)、24.97μmol/L(SARS-CoV);细胞毒性检测结果显示SLL-1A-46对三种细胞的半数毒性浓度(CC_(50))分别为75.41μmol/L(Vero E6)、39.96μmol/L(A549)和65.06μmol/L(293T);分子对接结果提示SLL-1A-46与两种M^(pro)活性位点处的结合能分别为-8.26 kcal/mol(MERS-CoV)和-8.37 kcal/mol(SARS-CoV)。[结论]初步筛选到11种抑制两种冠状病毒M^(pro)酶活性的小分子有机硒化合物,SLL-1A-46具有作为广谱冠状病毒M^(pro)抑制剂的潜力,其与两种M^(pro)的结合特点为广谱冠状病毒M^(pro)抑制剂的药物设计提供线索。

基于成分-单药-组方策略的中药抑制SARS-CoV-2主蛋白酶活性研究进展

新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)自从暴发以来对人类身体健康产生了严重威胁,主蛋白酶(Mpro)作为病毒基因复制和转录的主要参与酶,是研究抗新冠病毒药物的重要靶点。对于新型冠状病毒肺炎,中药防治具有巨大潜力,以经典方剂为基础开发的一些中药复方被应用于临床,取得了良好的效果。该文以天然活性成分-单味药-组方3个层面为基础,对SARS-CoV-2 Mpro以及相关中药抑制剂的研究进展进行综述,以期为开发出抗SARSCoV-2的中药特效药及中药复方提供思路。

新型冠状病毒奥密克戎变异株主蛋白酶的制备及其抑制剂的高通量筛选

目的基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理,建立奥密克戎变异株主蛋白酶(Omicron variant main protease,OM-Mpro)抑制剂高通量筛选模型,筛选新型OM-Mpro抑制剂。方法利用大肠杆菌进行OM-Mpro原核表达,再以HisTrap^(TM)亲和层析柱进行分离纯化。以FRET法进行OM-Mpro与野生型新型冠状病毒主蛋白酶(wild-type main protease,WT-Mpro)的酶活性测定并评价奈玛特韦的酶抑制活性。利用OM-Mpro抑制剂FRET高通量筛选模型对上市药物库进行高通量筛选。结果利用大肠杆菌成功进行了OM-Mpro原核表达与分离纯化,其与WTMpro酶活性无显著差异。奈玛特韦对OM-Mpro和WT-Mpro具有等同的酶抑制活性,说明奈玛特韦对奥密克戎变异株依然有效。通过对上市药物库进行高通量筛选,发现西吡氯铵是混合型OM-Mpro抑制剂,其半数抑制浓度值为8.76μmol·L^(-1)。结论成功制备了高活性OM-Mpro并建立了OM-Mpro抑制剂FRET高通量筛选模型,初步证实了西吡氯铵是混合型OM-Mpro抑制剂,为广谱抗冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。

SARS-CoV-2主蛋白酶耐药机制与抗耐药性药物化学策略

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)主蛋白酶(main protease,M^(pro))在病毒复制周期中发挥关键作用,是抗新冠病毒药物的重要靶点。然而,病毒的快速变异引起了对M^(pro)抑制剂的耐药性问题,对全球公共卫生构成严重威胁。对SARS-CoV-2 M^(pro)的耐药机制进行总结,并探讨了新型抗耐药性抑制剂的设计策略。针对M^(pro)耐药突变对现有抑制剂疗效的影响,提出了多种基于靶标结构的抗耐药性药物设计方法,如多位点占据、变构位点开发、共价结合等策略,此外还探讨了蛋白降解靶向嵌合体(proteolytic targeting chimera,PROTAC)在降解病毒靶蛋白中的应用。为解决SARS-CoV-2 M^(pro)耐药性问题提供了新思路,并为未来可能出现的冠状病毒疫情提供药物筛选和开发的参考。

沙蚕不同蛋白酶酶解产物滋味特征及聚类分析研究

目的研究沙蚕不同酶解产物中氨基酸和呈味核苷酸的含量、组成与呈味效果差异。方法以酱油粉为对照,采用味道强度值、味精当量、主成分分析法、聚类分析法进行分析和综合评价。结果沙蚕不同蛋白酶酶解产物中游离氨基酸总量在(90.84±1.12)~(151.25±0.95)mg/g之间;风味蛋白酶酶解产物的游离氨基酸和呈味氨基酸含量最高;胰蛋白酶组的味精当量值远高于酱油粉组;各组氨基酸对滋味有较大贡献,风味、胰蛋白酶组中谷氨酸的味道强度值与酱油粉组中该值接近,分别为37.13和35.40 mg/g。提取了4个主成分,累计方差贡献率达92.537%,较好地反应了酶解产物中游离氨基酸的综合信息,风味蛋白酶组综合得分最高,基于电子舌的滋味轮廓也支撑了这一结论。采用聚类分析将实验组分为4类,较直观地反映了不同酶解产物间的差异。结论风味蛋白酶和胰蛋白酶酶解沙蚕的产物游离氨基酸品质较好,且鲜味氨基酸含量和呈味核苷酸含量较高,可开发呈味基料。

蛋白酶对黄酒发酵的影响及挥发性成分分析

为了改善黄酒生产工艺,本文研究风味蛋白酶(Flavorzyme)、中性蛋白酶(Neutrase)、复合蛋白酶(Protamex)对黄酒发酵及风味物质的影响。采用传统摊饭法进行黄酒酿造,糖酵期添加蛋白酶,30℃发酵3 d后,再15 d低温发酵30 d,经压榨、灭菌得成品黄酒。测定了黄酒挥发性成分,筛选32种香气化合物进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)与聚类热图分析;并通过香气活力值(Odor Activity Value,OAVs)评价香气化合物对黄酒整体香气的贡献。结果表明,风味蛋白酶能促进酵母菌生长,提高酒精度,并促进挥发性成分生成,总酯含量上升了97.6%,与风味蛋白酶相关性高的琥珀酸二乙酯(r=0.992)、己酸乙酯(r=0.990)、乙酸异戊酯(r=0.987)和乙酸乙酯(r=0.982)等香气物质集中分布在第一象限,对第一主成分、第二主成分均有正向作用;风味蛋白酶提高了异戊醇、乙酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯等物质对黄酒整体香气的贡献率(OAVs>1),减少了4-乙基愈创木酚辛辣、刺激的气味。发酵过程中风味蛋白酶的添加能改善黄酒风味品质。

胃蛋白酶与胃蛋白酶原

胃蛋白酶是胃液中的主要消化酶，由氨基酸在胃腺的主细胞中合成，消化食物时，胃蛋白酶排出至胃腔内参与消化作用，消化活动停止时，又重新得到合成，以补充消耗，使胃蛋白酶始终能有充分的储备量。