鸡主要组织相容性复合体分子结构与抗病性关系研究进展

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)作为鸡免疫系统中的一个重要部分,主要负责将抗原表位递呈到特异性T淋巴细胞中,诱导免疫应答反应。鸡MHC优势表达1个MHCⅠ分子BF2和1个MHCⅡ分子BLB2,其中MHCⅠ分子结合来自细胞质中蛋白多肽,MHCⅡ分子结合来自细胞内囊泡中蛋白多肽和细胞外源性多肽。MHC等位基因多态性对其分子空间结构和结合肽段特性非常重要。不同单倍型MHC由于等位基因的差异其肽结合基序也存在差异,进而影响MHC分子递呈抗原肽数量,影响T细胞免疫应答强度,最终导致不同单倍型鸡对同一病原体表现出抗性或易感性。与人MHC分子相比,紧凑且简单的鸡MHC优势表达单个Ⅰ类分子的特性可以决定鸡是否会对某种病原体存在抗性。为了更好地认识鸡MHC分子在病毒感染过程中的作用及抗病性机制,解析其结构并进行功能研究非常必要。作者主要介绍了鸡MHC的分子结构特征,重点比较了不同单倍型MHC分子结构差异与抗病性的关系,总结了鸡MHC肽结合基序和禽流感病毒抗原肽的鉴定工作,为进一步理解MHC分子递呈肽给T淋巴细胞的机制和开发T细胞表位疫苗奠定基础。

重叠延伸PCR法体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ

本研究旨在体外重建鸡主要组织相容性复合体Ⅰ类分子(MHCⅠ)重链(α链)胞外区与轻链(β2m)成熟肽的重组嵌合分子。采用RT-PCR法分别扩增鸡MHCⅠ的重链胞外区和轻链的成熟肽序列;采用重叠延伸PCR(Splicing overlap extension PCR method,SOE-PCR)把通过45个碱基的链连接的鸡MHCⅠ重链胞外区基因和轻链成熟肽基因重组到可溶性表达质粒pMAL-p2X进行可溶性表达。经琼脂糖凝胶电泳证明RT-PCR可分别扩增出鸡MHCⅠα链胞外区基因和β2m成熟肽基因,大小符合预期。采用MHCⅠα链胞外区序列的反义引物与β2m成熟肽基因正义引物有15个碱基重叠的两对引物,以MHCⅠα链胞外区序列与β2m成熟肽序列PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸获得了预期大小的连接片段;测序显示重组质粒上MHCⅠα链胞外区序列与轻链β2m成熟肽基因的靶序列由一柔性的linker相连,阅读框正确且无移码。本研究表明SOE-PCR是体外重构鸡MHCⅠ的一种简捷可行方法。

红笛鲷主要组织相容性复合物Ⅰα抗原基因的克隆与表达分析

为研究红笛鲷免疫防御相关基因的作用机理和调控机制,实验应用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)成功克隆了红笛鲷组织相容性复合物Ⅰα(MHCⅠα)抗原基因的全长cDNA序列,MHCⅠα的全长序列为1 369 bp,编码354个氨基酸残基。BLAST分析显示,红笛鲷MHCⅠα与其他已知物种MHCⅠα基因的最高同源性为84%。构建的系统进化树显示,红笛鲷MHCⅠα与石斑鱼等MHCⅠα亲缘关系较近。Real-time PCR分析表明,MHCⅠα在头肾中的最大表达量出现在哈氏弧菌ZJ0706诱导后6～15 h内;构建的重组表达质粒pET32a-MHCⅠα经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了正确表达。将纯化后的重组蛋白与佐剂混合后免疫新西兰纯种大白兔制备多克隆抗体。ELISA检测显示,所获得的兔抗血清效价约为1∶40 000。Western blot检测发现,本实验制备的抗血清能特异性地与重组蛋白发生抗原抗体反应。

滋养层细胞表面主要组织相容性复合体抗原的研究进展

胎盘滋养层是直接与母体接触的与母体基因型不同的胎儿组织 ,滋养层细胞是否表达主要组织相容性复合体 (MHC)抗原以及表达何种MHC抗原对于妊娠成功与否至关重要 .非经典MHCⅠ类抗原发现较晚 ,其中HLA G在滋养层细胞表达 ,可以保护带有父方同种异体抗原的胎儿免受母体免疫系统的杀伤 .经典MHCⅠ类抗原有多种亚型 ,不同亚型在滋养层细胞的表达有所不同 .MHCⅡ类抗原在妊娠维持过程中表达极弱 ,新近的研究资料表明 ,滋养层细胞CⅡTA在MHCⅡ类基因表达调控中起主要作用 .

草鱼MHC class Ⅰ基因多态性及其与鱼体抗柱形病能力关系分析

用1对引物HMC6-S和MHC6-A分别从草鱼(Ctenopharyngodon idellus)40尾抗病个体和40尾易染个体的基因组DNA中扩增MHC基因片段,扩增产物长度为262bp。在262bp的核苷酸序列中,有50个(19%)多态位点。在其编码的87个氨基酸位点中,有16个多态位点(18.39%),其中有10个位点发生在多肽结合位点上(62.5%)。对核苷酸替代的类型和位点进行分析,发现多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率均大于非多肽结合位点的非同义碱基替代率与同义碱基替代率,表明氨基酸替代替换集中出现在多肽结合位点(PBR)上。分析80个个体的测序结果,发现有17种不同的MHC classⅠ等位基因,编码17种不同的氨基酸序列。等位基因A、B、C、D是2个群体共有的,其中等位基因A出现的频率最高,占总样本数量的36.25%;等位基因E、F、G、H、I、P只出现在抗病个体中,等位基因J、K、L、M、N、O、Q只出现在易染个体中。

白鹭MHCⅡDABⅠ基因第二外显子的多态性与进化

克隆测序白鹭(Egretta garzetta)5个种群138份个体组织样本的主要组织相容性复合体Ⅱ类B基因(MHCⅡDABⅠ)第二外显子(exon2)序列,分析探讨exon2的多态性、进化选择、系统关系和种群遗传结构.主要结果如下:白鹭MHCⅡDABⅠexon2序列长度为270bp,共计定义了139个等位基因;序列分析显示exon2有101个核苷酸变异位点(37.4%)和31个氨基酸变异位点(34.4%);基于贝叶斯法构建的系统树显示白鹭MHCⅡDABⅠexon2有5个高支持率的谱系;肽结合位点(PBR)、非肽结合位点(non-PBR)的非同义替换率(dN)和同义替换率(dS)比值计算显示,PBR的dN/dS为1.99(p<0.05),而non-PBR的dN/dS则略小于1(p>0.05),表明白鹭MHCⅡDABⅠexon2受到正选择作用;根据等位基因在群体中的分布频率作分子方差分析(AMOVA),得到群体间分化指数(FST)为0.194 1(p<0.000 1),提示白鹭MHCⅡDABⅠexon2存在显著的种群遗传结构分化.

玻璃红鲤MHCⅡ类基因多态性与组织表达分析

以cDNA为模板进行PCR扩增和克隆分析,从7尾玻璃红鲤(Cyprinus carpio var.wananensis)的70个有效克隆中,获得长度为624 bp的MHC IIα/β不同编码序列25/31个,分属于7/10个不同等位基因,揭示玻璃红鲤MHC II类基因的多态性仍较丰富。其中Cyca-DXA17*01和Cyca-DAB1*1201、Cyca-DAB1*1301、Cyca-DAB3*1901、Cyca-DAB3*2001、Cyca-DAB3*2101、Cyca-DAB3*2201为新发现的7个基因。分析表明,α1/β1结构域的核苷酸/氨基酸变异位点数明显高于α2/β2结构域;α1、β1结构域抗原结合位点(PBR)的ω值(ω=dN/dS,5.209和1.703)都大于1,揭示玻璃红鲤MHC II类基因在进化过程中受到正向选择作用。半定量分析显示,玻璃红鲤MHC II类基因在肾和脾中有较强表达,中等程度表达于胃、肝和肠,而鳃、心和眼的表达较弱。

中华鲟野生群体及迁地群体的MHCⅠa基因遗传多样性变异研究

利用特异性引物MHCⅠf和MHCⅠr,分别从30尾野生中华鲟(Acipenser sinensis)、30尾中华鲟子一代和30尾中华鲟子二代的基因组DNA中扩增MHCⅠa基因的多肽结合位点(PBR)片段,扩增产物长度为127 bp。中华鲟野生群体30个样品265个有效克隆中共检测出50条特异序列(单倍型),中华鲟子一代群体30个样品的278个有效克隆中共检测出66条特异序列(单倍型),中华鲟子二代群体30个样品的257个克隆中检测出64条特异序列(单倍型)。单倍型Acsi-UAB*0101在3个群体中所占的百分比最高,分别为58.1%、38.8%和60.7%。单倍型分布及群体内遗传多样性参数分析表明,中华鲟子一代群体的MHC基因遗传多样性最丰富,野生中华鲟群体的MHCⅠa基因遗传多样性较低。中华鲟野生群体非同义替代与同义替代比率为1.33,分析表明正向选择可能是中华鲟MHCⅠa多态性的主要因素。该研究结果提供了中华鲟从野生群体到子二代群体MHCⅠa基因的部分遗传信息和遗传变异规律,为中华鲟全人工种群优化和繁殖管理提供理论依据。

莆田黑鸭MHCⅠ基因外显子2的遗传多态性

以莆田黑鸭为材料,对其主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ基因外显子2进行PCR扩增和DNA测序,分析其遗传多态性及变异特征,为进一步寻求抗病分子提供依据.结果表明,莆田黑鸭MHCⅠ基因外显子2处有丰富的遗传多态性,核苷酸变异以颠换为主,同义替换率大于非同义替换率,总GC含量较高,为59%,其中,密码子第3位的GC含量最高,为82.7%.莆田黑鸭MHCⅠ基因外显子2编码的氨基酸有明显的疏水性,对维持MHC分子的结构和功能具有重要作用.聚类分析结果表明,禽类分支中,莆田黑鸭与家鹅的亲缘关系较近,与鸡的亲缘关系较远.

DF-1细胞MHC单倍型的分子鉴定

为了鉴定鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)单倍型,试验选取生长状态良好的DF-1细胞,提取其总RNA并将总RNA反转录成cDNA;以DF-1细胞cDNA为模板,采用PCR方法扩增鸡MHC B基因座的微卫星LEI0258和MCW0371及BF2、BLB2基因并测序,同时采用“PCR+1”方法扩增BF2基因并测序,以根据上述序列及结构特征判定DF-1细胞的MHC单倍型。结果表明:微卫星LEI0258和MCW0371序列长度分别为357,205 bp,其中微卫星LEI0258含有1个CTATGTCTTCTTT重复单元和16个CTTTCCTTCTTT重复单元,与MHC B基因座B130、B131、B201、B5.1、B6.1、B21、B75单倍型的微卫星长度、重复单位的结构和数量完全相同;BF21基因序列长度为1117 bp,与GenBank收录3条鸡MHC B21单倍型的BF2基因序列(登录号分别为AF013493.1、S78682.1、NM-001031338.2)完全一致。说明DF-1细胞来源于MHC B21单倍型纯合鸡胚。

健脾解毒方延长脾虚肝癌大鼠带瘤生存与MHCⅠ/MHCⅡ的关系

目的:探讨健脾解毒方延长脾虚肝癌模型大鼠带瘤生存及与MHCⅠ/MHCⅡ的关系。方法:105只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组、肝癌模型组、脾虚模型组、脾虚肝癌模型组、胸腺五肽组及健脾解毒方低、高剂量组,进行造模和干预。实验中记录动物的体质量、生存时间、肝癌大鼠濒死状态时恶液质积分并采集标本。免疫组化与Western blot方法检测大鼠肝组织及肝癌组织MHCⅠ/MHCⅡ分子表达。结果:健脾解毒方高剂量组和胸腺五肽组累积生存率高于其余各组(P<0.05),且其恶液质评分低于其余各组(P<0.05)。各造模组中,MHCⅠ分子在肝组织中的表达水平高于癌组织,肝组织和癌组织中均以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01)。MHCⅡ分子在癌组织表达强于肝组织,肝组织中以健脾解毒方高剂量组表达最强(P<0.01),癌组织中以脾虚肝癌组表达最强(P<0.01)。结论:健脾解毒方能对抗移植瘤导致的恶液质的发生和进展,显著延长荷瘤鼠的生存时间,其作用可能与上调MHCⅠ/MHCⅡ有关。

鸡MHC与传染性疾病遗传抗性的相关性研究进展

鸡是我国主要的家禽品种,抗病分子育种在鸡的疾病尤其是传染病控制中有着重要地位,抗性基因选择是其技术关键。鸡主要组织相容性复合体(MHC)基因具有高度多态性,与多种传染性疾病抗性紧密相关,受到家禽育种专家的高度关注。文章介绍国外有关鸡MHC与传染性疾病抗性的相关性及抗性基因研究进展,并展望其在鸡抗病育种中的应用前景。

长江草鱼群体MHC Class ⅡB的多态性和进化分析

克隆及测序草鱼（Ctenopharyngodon idella）长江3个群体的主要组织相容性复合体（MHC）Class II B基因编码β1和β2区的第2和第3个外显子及两个外显子之间的内含子,分析了草鱼MHC的进化模式和种群遗传结构。结果显示：实验共定义了34个等位基因,每条序列包括长为130~136 bp的第2个外显子,长为218 bp的第3个外显子以及长81~371 bp的内含子。序列分析揭示,第2个外显子有106个核苷酸变异位点（78%）和40个氨基酸变异位点（88%）,而第3个外显子有100个核苷酸变异位点（45%）和41个氨基酸变异位点（56%）,β1变异要大于β2区。用β1和β2区序列分别构建的邻接（NJ）系统树均显示5个具有高支持率的谱系,结合序列变异特点和内含子长度,推测草鱼至少存在5个MHC Class II座位。分别计算β1的肽结合位点（PBR）、非肽结合位点及β2的非同义替换率（dN）和同义替换率（dS）,PBR的dN/dS为2.03（P〈0.05）,非肽结合位点和β2则小于1,表明草鱼MHC受到歧化选择作用。根据等位基因在群体中的分布频率作分子方差分析（AMOVA）,得出FST为0.37%,提示长江草鱼MHC没有遗传分化。

中华鳖群体间编码MHCⅠ类分子α_2结构域基因的克隆及序列分析

通过主要组织相容性复合体（MHC）基因的分析，探讨了中华鳖5个群体（黄河、淮河、洞庭湖、鄱阳湖、太湖）间的遗传变异与分化。中华鳖编码MHCⅠ类分子α2结构域基因的多态性很丰富。主要表现在：（1）中华鳖编码MHCⅠ类分子α2结构域的基因序列存在插入或缺失变异，共获得7种不同长度的基因序列，其中222bp、231bp分别在42、23个体出现，为两种主要长度的基因序列；（2）共获得41种不同的核苷酸序列，这些核苷酸序列的相似度在0．386—0．995之间，表明序列间的歧异度较大；（3）在所有核苷酸序列中，共有250个有效位点，其中174个为变异位点，多态位点百分率达69．6％，但群体间存在差异：①多态位点百分率大小顺序为鄱阳湖鳖（71．02％）〉太湖鳖（58．05％）〉淮河鳖（57．69％）〉黄河鳖（55．32％）〉洞庭湖鳖（48．09％）；②核苷酸多样性指数（π）大小顺序为鄱阳湖鳖（0．4273）〉太湖鳖（0．2872）〉洞庭湖鳖（0．2840）〉黄河鳖（0．2727）〉淮河鳖（0．2463）；（4）分子方差分析（AMOVA）表明，太湖鳖与黄河鳖、淮河鳖2群体间，淮河鳖与洞庭湖鳖间有极显著的遗传分化（P〈0．001）；（5）根据核苷酸序列的平均遗传距离，用UPGMA和NJ法进行聚类分析，黄河鳖与淮河鳖、洞庭湖鳖与太湖鳖分别先聚在一起，最后再与鄱阳湖鳖聚类，显示鄱阳湖鳖与其它4群体中华鳖在MHC基因上有明显歧化。

云南高峰牛MHC-DQB基因外显子2遗传多态性分析

本研究采用PCR直接测序和PCR-RFLP法研究了云南高峰牛MHC-DQB基因外显子2(DQB.2)的遗传多态性,并利用DNAMAN软件分析了云南高峰牛与部分物种DQB.2相应核苷酸序列的同源性。结果发现,共检测到了17个等位基因,其中HaeⅢ酶切位点存在10种基因型,由A、B、C、D和E 5个复等位基因控制;RsaⅠ酶切位点存在22种基因型,由A、B、C、D、E、F、G、H、I、J和K共11个复等位基因控制;TaqⅠ酶切位点只出现了1种基因型。分析发现,云南高峰牛DQB.2基因的12、25、63、96、106、126、152、156、165、204位的碱基表现出了多态性。所分析的物种该基因片段大小相同均为270bp,云南高峰牛第224位碱基缺失及236位碱基插入现象。云南高峰牛与人、猪、马、绵羊、黄牛×瘤牛的核苷酸序列的同源性分别为81.4%、83.3%、78.1%、87.7%、86.6%。经χ2检验结果表明,HaeⅢ和TaqⅠ酶切位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05),而RsaⅠ酶切位点则未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P<0.05)。

卵巢上皮性癌组织及血清中MICA的表达和含量及临床意义

目的:检测卵巢上皮性癌组织及血清中主要组织相容性复合体相关蛋白A(MICA)的表达和含量,探讨其与卵巢上皮性癌细胞分化程度、组织学类型、临床分期的关系及临床意义。方法:免疫组化SP法检测卵巢上皮性癌(59例)及卵巢上皮性良性肿瘤组织(12例)、正常卵巢上皮组织(15例)膜型主要组织相容性复合体相关蛋白A(mMICA)的表达;ELISA法检测卵巢上皮性癌、卵巢上皮性良性肿瘤及健康人(15例)血清可溶性主要组织相容性复合体相关蛋白A(sMICA)的含量。结果:①mMICA在卵巢上皮性癌和卵巢上皮性良性肿瘤组织表达阳性率分别为72.88%、8.33%,差异有高度统计学意义(P<0.01)。在卵巢上皮性癌低分化组和中分化组表达阳性率分别为90.48%、63.16%,Ⅰ～Ⅱ期组和Ⅲ～Ⅳ期组表达阳性率分别为45.45%、79.17%,差异均有统计学意义(P<0.05)。在正常卵巢上皮组织不表达。②血清中sMICA含量,卵巢上皮性癌20.79±8.37ng/ml、卵巢上皮性良性肿瘤9.98±1.75ng/ml、健康人6.47±1.69ng/ml,差异有高度统计学意义(P<0.01)。在卵巢上皮性癌低分化组含量高于中分化组,Ⅲ～Ⅳ期组高于Ⅰ～Ⅱ期组,差异有统计学意义及高度统计学意义(P<0.05,P<0.01)。③在卵巢上皮性癌不同组织学类型的卵巢上皮组织中mMICA的表达阳性率及血清中sMICA含量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:卵巢上皮性癌组织mMICA表达阳性率及血清中sMICA含量均较高,且均与卵巢上皮性癌细胞分化程度、临床分期有关。检测血清sMICA含量可能作为辅助诊断及评价卵巢上皮性癌病情的一个指标。

中华菊头蝠MHC Ⅱ-DRB基因遗传多态性及进化

采样自云南同一种群的中华菊头蝠共16个个体,用于DRB基因的分子进化和多态性研究。利用翼膜组织提取DNA基因组,并PCR克隆测序分析。获得了相差3 bp的两种不同长度序列类型,A序列类型263 bp,在研究群体中有15个等位基因;B序列类型260 bp,在研究群体中有8个等位基因。在分析的74个氨基酸变异位点上检测到12个正向选择位点。在9个个体中检测到分布频率最高的等位基因,也有多个等位基因只存在一个个体中。单个个体中最多存在6个等位基因。遗传多态性分析表明中华菊头蝠DRB基因具有较高的多态性。中华菊头蝠DRB基因可能至少存在3个重复座位。利用已发表的翼手目DRB第二外显子序列构建的系统进化树表明中华菊头蝠MHCⅡ-DRB基因处于独立进化支。

寒凝血瘀型原发性痛经与MHC基因多态性的关联研究

目的:探讨北方地区汉族人寒凝血瘀型原发性痛经(PD)与人类主要组织相容性复合MHC基因多态性的关系。方法:应用顺序特异性引物和聚合酶链反应(PCR-SSP)技术,对64例原发性痛经患者及85例无血缘关系的健康人的MHC各等位基因及亚基因进行了检测分析,并将该方法与其它检测MHC等位基因的方法进行对比。结果:结果表明,MHC-DRB1*09(RR=4.202,P<0.05)基因与PD正相关,显著高于对照组,两组之间比较差异有显著性意义,而其它MHC-DRB1*各等位基因未见异常,均无统计学差异。结论:本项研究结果提示,MHC-DRB1*09基因可能是我国北方汉族人PD致病的易感基因,为揭示PD的发病机制中免疫遗传学作用提供了重要信息和依据。

虎MHC ClassⅠ基因的克隆及测序

根据猫的主要组织相容性复合体Ⅰ类分子cDNA序列设计PCR引物,从基因组上成功扩增并克隆了MHCClassⅠ基因片段,命名为TLA-A。该片段全长2 820 bp,包含MHC ClassⅠ分子基因约85%的长度,包括Exon 1部分序列、intron 1、exon 2、intron 2、exon 3、intron 3、exon 4、intron 4、exon 5、intron 5、exon 6、intron 6和exon 7部分序列。与其他物种的ClassⅠ基因相比,虎与家猫、猎豹、豹猫、大熊猫、狗、马、松鼠猴、人、黄猩猩等物种的同源性依次为93.4%、91.8%、87.3%、86.4%、85.1%、85.1%、84.6%、84.3%、83.7%,种间序列差异主要表现在exon 2、exon 3两个肽结合区。

辽东湾斑海豹MHC-DQB基因的遗传多样性分析

本文从25份斑海豹样本中获得141bp片段,发现21个变异位点,定义了12个MHC-DQB等位基因,氨基酸变异率为25.5%。等位基因之间的遗传距离范围是0.0071～0.1064,平均值为0.0577,不同等位基因之间的碱基差异是1～15bp,平均差异数为8bp。与其他鳍足类动物对比后发现,斑海豹MHC-DQB表现出较丰富的多态性。非同义替换率明显高于同义替换率,由此造成的氨基酸替换集中在肽结合位点PBR附近,表明DQB基因受到强烈的平衡选择作用。11个样本出现多于两条等位基因的情况,推测存在基因重复现象。