幽门螺杆菌临床菌株主要蛋白抗原表达及其诱导宿主产生抗体差异性的研究

建立了基于幽门螺杆菌重组蛋白抗原rUreB、rHpaA、rVacAr、CagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB的ELISAs,用于检测幽门螺杆菌临床菌株上述抗原表达率和幽门螺杆菌感染病人血清IgG阳性率,另采用PCR检测临床菌株中上述抗原编码基因携带率,以期为选择幽门螺杆菌基因工程疫苗抗原提供依据.实验结果显示,rUreB、rHpaA、rVacAr、CagA1、rNapA、rFlaA和rFlaB表达量分别约为细菌总蛋白的35%、32%、15%、23%、56%、25%和20%.各重组抗原均能与商品化幽门螺杆菌抗血清(DAKO)产生阳性Western Bolt结果,免疫家兔能产生特异性抗体.从332例慢性胃炎或消化性溃疡病人胃黏膜活检标本中,分离获得145株幽门螺杆菌,其阳性率为43.8%.所有幽门螺杆菌临床菌株均表达UreB、HpaA、FlaA和FlaB,52.4%、91.7%和93.1%菌株分别表达VacA、CagA和NapA.145例幽门螺杆菌感染的病人血清中,UreB、HpaA、VacA、CagA、NapA、FlaA和FlaB的IgG抗体阳性率分别为100%、86.9%、42.8%、70.3%、89.7%、84.8%和79.3%.此外,不同胃疾病标本中幽门螺杆菌分离率均无显著性(P>0.05),但菌株VacA和NapA表达率与疾病严重程度相关(P<0.05).综合分析实验结果,UreB是研制幽门螺杆菌基因工程疫苗首选抗原,其次是NapA和HpaA;各病种与幽门螺杆菌感染率无关,但与菌株毒力有关.

猪细小病毒VP2蛋白的主要抗原表位基因的原核表达及检测应用

将构建好的重组质粒PET-VP2Ⅰ转化宿主菌BL21,利用IPTG(1mmol/L)诱导实现了PET-VP2Ⅰ蛋白主要抗原域VP2Ⅰ融合蛋白的高效表达。通过Western-blot检测证明表达的重组蛋白具有良好的免疫学活性。表达产物经HisBind层析柱纯化后作为诊断抗原初步建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:抗原的最佳包被浓度为3.5μg/mL,血清的最佳稀释度为1∶40,待检血清阳性标准初步定为OD490>0.51,且待检血清的OD490值与阴性血清的OD490值的比值大于2.1。

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用 Pichia pastoris 酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV) S 蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出 CCV DXMV 株 S1 基因片断,并将其克隆到 pGEM-T 载体中得到 pTS1。用 Kpn I 和 NotI 双酶切pTS1 回收目的基因 S1 定向克隆到 pPICZαA 中,构建出重组质粒 pPICZαAS1。将 pPICZαAS1 用 Sac I 内切酶线性化后,电转化感受态 GS115 酵母细胞,用 PCR 法筛选阳性重组子。用 1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用 SDS-PAGE 电泳可检测到相对分子量为 106kDa 大小的重组蛋白, Western-blot 证实该重组蛋白可以与 CCV 多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3 株重组酵母菌在 1%甲醇诱导 144h 后,重组蛋白 S1 表达量约占培养物上清总蛋白量的 6.6-8.6%左右。用重组蛋白 S1 免疫 BALB/C 小鼠 3 次后,小鼠血清 CCV 中和抗体可达 1:8-1:16,表明重组 S1 蛋白具有一定的免疫原性。

乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性。在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据。

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建

构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis hear shock protein70,Mt．hsp70)的肽连接区(Binding domain)基因融合表达载体,利用酵母表达系 统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。以酵 母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵 母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。E蛋 白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为 68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。将 用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段(另文发表)与上述融合蛋白均以50pmol． 的量分别对6-8周龄的:BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增 殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗 原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表达

为了克隆乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因的原核表达系统，试验采用RT—PCR方法扩增乙型脑炎病毒E蛋白上2个重要抗原域73～88aa和292～402aa，并将其定向连接至原核表达载体pET-32a（＋），构建重组质粒pET—EAB，再将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，用IPTG进行诱导表达，应用SDS—PAGE和Western—blot技术对表达产物进行检测与鉴定。结果表明：经SDS—PAGE分析，表达出的目的蛋白主要以包涵体形式存在；再使用Western—blot技术对纯化复性后的包涵体进行检测，证实其具有免疫活性。

禽网状内皮组织增殖病病毒PCR及RT-PCR检测方法的研究和p30主要抗原域的原核表达

根据MONAM.ALY发表的一对引物,5'-CATACTGGAGCCAATGGTGTAAAGGGCAGA-3'(上游引物),5'-AATGTTGTAGCGAAGTACT-3'(下游引物),上游引物位于REV-SNV毒株LTR序列上游237bp到267bp,下游引物在499bp到517bp之间,扩增产物总长为281bp。以REV-T株感染的鸡胚成纤维细胞DNA作为PCR扩增模板,进行PCR扩增,提取病毒RNA进行RT-PCR,这两种方法均获得了禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,将其克隆入pGEM-TEasy克隆载体中,经测序,证实为禽网状内皮增生症T株的部分LTR序列,初步建立了REV的PCR和RT-PCR检测方法。人工合成了REVp30的主要抗原域,用构建成功的表达禽网状内皮增生症p30主要抗原域的原核表达载体pET-p30,转化大肠杆菌BL21,挑取阳性克隆培养,IPTG诱导后裂解菌体作SDS-PAGE分析,出现大小约25Ku的表达产物即融合蛋白TrxA-p30主要抗原域,经Westernblot验证融合蛋白具有REV特异的反应原性。采用常规表达条件:LB培养基,37℃培养,待菌生长至OD600为0.4h～0.6h,用终浓度为0.2mmol/L～0.8mmol/L的IPTG进行诱导,于37℃振荡培养4h～5h,均能高效表达。本研究为建立REV抗体的ELISA检测方法打下基础。

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E

猪细小病毒VP2蛋白主要抗原表位区的原核表达及检测PPV抗体的间接ELISA的建立

利用大肠杆菌表达51ku的猪细小病毒(PPV)VP2蛋白主要抗原表位区,通过Western-blot检测,表达蛋白具有良好的反应原性。利用此表达蛋白建立了检测PPV抗体的间接ELISA。通过检测32份阴性血清最终确定本ELISA的判定标准为:血清抗体效价>0.18,判为PPV血清抗体阳性;血清抗体效价≤0.18,判为血清抗体阴性。此ELISA的批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%。用此ELISA与商品化PPV IgG检测试剂盒做符合性比较试验;结果,感染猪血清抗体检测符合率为100%,免疫猪血清抗体检测符合率为82%,非免疫健康猪血清抗体检测符合率为78%,样本总体检测符合率为80%。用建立的ELISA检测田间猪血清的PPV抗体,阳性率介于28.8%~37.5%之间,提示上述地区可能存在不同程度的PPV感染情况。本研究为PPV免疫或感染状况的检测提供了一种有用的定性诊断方法。

Establishment of an Indirect ELISA with the Major Epitope Domain of ApxⅡ of Actinobacillus pleuropneumoniae Expressed in Prokaryotic Cells

[Objective] This study aimed to develop an indirect ELISA to detect the antibodies against Actinobacil us pleuropneumoniae （APP） using the recombinant ApxⅡA1 protein expressed in prokaryotic cells as the antigen. [Method] The major epi-tope domain of ApxⅡ was cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a （＋） to obtain the recombinant plasmid pET-ApxⅡA1, which was then transformed into E. coli BL21 （DE3） for expression. The immunogenicity of the recombinant pro-tein was analyzed by western-blotting. After that, the purified recombinant protein was used as the coating antigen in the indirect ELISA for detecting the antibodies against APP. Final y, the concentration of coated antigen and the dilution of serum were optimized. [Result] Proved by enzyme digestion and sequencing, the recombi-nant plasmid pET-ApxⅡA1 was constructed successful y. The recombinant protein was highly expressed in prokaryotic cells, and Western-blotting analysis showed that it was recognized specifical y by positive serum of APP. The indirect ELISA could detect the antibody against APP with the purified recombinant protein as the coating antigen. The optimal concentration of coated antigen was 1.23 μg/ml and the opti-mal dilution of serum was 1：100. Compared with a commercial ELISA kit detecting antibody against ApxⅣ, the coincidence rate of the indirect ELISA was 90.4%. [Conclusion] Our results indicated that the indirect ELISA is sensitive and specific, and suitable for evaluating the effect of APP vaccine and epidemiological surveys.

猪瘟病毒血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立快速、准确的猪瘟病毒(CSFV)血清抗体检测方法,根据Gen Bank上猪瘟兔化弱毒全基因序列,设计1对引物,扩增E2蛋白主要抗原区基因片段;然后,将其克隆入载体p ET-28a(+),采用大肠杆菌Rosetta(DE3)表达出含E2蛋白主要抗原区的重组蛋白。以纯化的截短E2蛋白为包被抗原,优化间接ELISA反应条件,建立了检测CSFV血清抗体的间接ELISA。经过优化,确定最佳抗原包被浓度为8 g/m L,待检血清稀释倍数为1∶160,酶标二抗稀释倍数为1∶2000。该方法的阳性临界值为0.37,阴性临界值为0.32。批内变异系数在1.58%~3.33%之间,批间变异系数在2.67%~5.35%之间,说明该方法重复性良好。特异性检验中,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪流行性腹泻病毒、猪流感病毒、传染性胃肠炎病毒、乙型脑炎病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒阳性血清均没有交叉反应。用该方法与IDEXX CSFV抗体检测试剂盒对1 101份临床猪血清样品进行符合性检测,结果,该方法的敏感性、特异性、符合率分别为89.07%(603/677)、77.59%(329/424)和84.65%(932/1101)。上述结果表明,该方法可用于临床CSFV血清抗体的检测,为CSFV血清抗体检测试剂盒的研制奠定了基础。

携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性

将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB。将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达。质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性。动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P<0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P<0.01)。上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础。