重组人源肺孢菌主要表面糖蛋白C共有抗原在肺孢菌肺炎诊断中的价值

目的评价重组人源肺孢菌主要表面糖蛋白C(Msg C)共有抗原在肺孢菌肺炎(PCP)诊断中的临床价值,以探索PCP的血清学诊断新方法。方法建立检测血清抗人源肺孢菌Msg C共有抗原IgM抗体酶联免疫吸附测定(ELISA)方法,对48例PCP高危人群(高危组)和51名健康人群(对照组)血清进行抗Msg C共有抗原IgM抗体和(1, 3)-β-D葡聚糖检测,并与支气管肺泡灌洗液的PCR结果进行比较分析。结果总共99例标本中抗Msg C共有抗原IgM抗体检测和(1, 3)-β-D葡聚糖检测阳性率分别为28.3%(28/99)和25.3%(25/99),P>0.05;高危组48例标本中两者阳性率分别为35.4%(17例)和33.3%(16例),P>0.05;两种检测方法在总共99例标本和高危组标本检验结果一致性分别为67.7%和52.1%。高危组支气管肺泡灌洗液标本PCR检测15例阳性,与抗Msg C共有抗原IgM抗体检测差异无统计学意义(P=0.665);抗Msg C共有抗原IgM抗体检测与PCR检测结果一致性为58.3%;在两种血清学方法检验结果一致的25例标本中,与PCR检验结果一致性提升到84.0%;若以任一种血清学阳性结果作为判读阳性标准,高危组15例PCR阳性标本检出率达86.7%(13/15)。结论抗Msg C共有抗原IgM抗体联合血清学指标(1, 3)-β-D葡聚糖检测对PCP诊断具有一定价值,两者均为阳性时应进一步进行下呼吸道标本PCR检测和传统细胞学染色检查。

卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白上游保守序列基因microRNA表达载体的构建和鉴定

目的:构建和鉴定卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,MSG)表达调控基因上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA表达载体,并在体外转染到PC中观察其对PC的抑制作用。方法:设计并人工合成针对PC MSG-UCS基因的1对microRNA序列并定向克隆到表达载体pcDNA^(TM)6.2-GW/EmGFPmiR上,序列正确的载体用脂质体转染PC细胞,RT-PCR检测其对PC MSG-UCS基因的抑制作用,扫描电镜观察PC的超微结构变化。结果:凝胶电泳和测序鉴定得到的产物与预期的目的基因一致,其在mRNA水平能明显抑制PC的表达并能破坏PC的超微结构。结论:PC MSG-UCS基因的microRNA表达载体pPC-UCSm构建成功,并能在体外抑制PC的表达。

HIV感染和非HIV感染人群抗耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白的IgG和IgM抗体水平调查

目的对北京地区HIV和非HIV人群抗耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,Msg)IgG、IgM抗体滴度水平进行调查,探索其在流行病学调查中的价值。方法利用重组Msg融合蛋白作为抗原建立酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用阴性标准血清等比例稀释样本血清建立相对定量抗体检测方法,对176例HIV感染者和226例非HIV人群血清样本进行抗Pj Msg IgG和IgM抗体定量水平调查,所有入选患者临床均不诊断肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)。结果抗Pj Msg IgG抗体在非HIV人群中阳性率为42.5%(113/266),113例阳性标本中1∶100、1∶200、1∶400和1∶800滴度分别为77例(68.1%)、15例(13.3%)、6例(5.3%)和15例(13.3%);抗Pj Msg IgG抗体在HIV感染者中阳性率为24.4%(43/176),43例阳性标本中1∶100、1∶200、1∶400和1∶800滴度分别为28例(65.1%)、10例(23.3%)、3例(7.0%)和2例(4.7%),与非HIV组相比差异无统计学意义(χ~2=4.254,P=0.235)。抗Pj Msg IgM抗体在非HIV人群中阳性率为41.7%(111/266),111例阳性标本中1∶100、1∶200、1∶400和1∶800滴度分别为57例(51.4%)、21例(18.9%)、19例(7.1%)和14例(12.6%);抗Pj Msg IgM抗体在HIV感染者中阳性率为12.5%(22/176),22例阳性标本中1∶100、1∶200、1∶400和1∶800滴度分别为10例(45.5%)、2例(9.1%)、4例(18.2%)和6例(27.3%),与非HIV组相比差异无统计学意义(χ~2=3.788,P=0.285)。结论非PCP人群中抗Pj Msg IgG抗体定量水平主要集中在1∶100和1∶200低滴度水平区间,抗Pj Msg抗体水平的定量检测方法及其临床意义值得进一步研究。

耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白合成及人群IgG抗体调查

目的原核表达耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii,Pj）主要表面糖蛋白（major surface glycoprotein,Msg）氨基端片段,获得可溶性Pj重组Msg抗原（recombinant Msg,rMsg）,利用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体。方法从耶氏肺孢子菌感染者的痰液获得Pj DNA,构建表达载体pGEX-3X-Pj Msg,转化感受态大肠埃希菌DE3,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达。利用谷胱甘肽转移酶（GST）标签进行亲和纯化,对纯化Pj rMsg抗原进行鉴定并建立ELISA方法,检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体。结果成功构建了表达质粒pGEX-3X-Pj Msg,并诱导表达分子质量单位约39ku的可溶性Pj rMsg蛋白,产量为13mg/500ml菌液,以此为抗原,采用ELISA检测266例成年人外周血抗Pj rMsg IgG抗体,阳性率为42.5%（113/266）。其中男、女性患者阳性率分别为43.3%（58/134）和41.7%（55/132）,差异无统计学意义（χ2=0.071,P〉0.05）;20~29岁、30~39岁、40~50岁组阳性率分别为31.8%（27/85）、48.3（42/87）和46.8%（44/94）,差异无统计学意义（χ2=5.911,P〉0.05）。结论成功表达了可溶性Pj rMsg抗原,Pj rMsg-ELISA检测结果表明北京地区成人耶氏肺孢子菌感染率较高。

中国耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白UCS基因分型研究

目的以主要表面糖蛋白上游保守区UCS基因对中国耶氏肺孢子菌进行基因多态性分析。方法用巢式PCR扩增127例耶氏肺孢子菌感染患者呼吸道标本中主要表面糖蛋白上游保守区UCS基因,通过DNA直接测序获得该基因的序列,并随机选取部分标本经过克隆测序,分析其UCS串联重复区序列的特征,并分析不同患者人群中基因多态性分布。结果共获得97例（占76.4%）患者标本的UCS基因序列,依据串联重复单元的数目、序列不同得到2~5个重复的7种基因型,其中基因型1,2,3（占68.04%）最为常见,其次为基因型1,2,3,3（占21.65%）。在6组患者中,基因型1,2,3亦最为常见。结论本研究获得了我国耶氏肺孢子菌UCS基因多态性的基础资料,为进一步分析耶氏肺孢子菌的遗传学、流行病学提供了依据。

HIV-1感染者抗耶氏肺孢子菌主要表面糖蛋白抗体筛查

目的利用原核表达的耶氏肺孢子菌（Pj）重组主要表面糖蛋白（rMsg）建立酶联免疫吸附试验（ELISA）方法,调查176例艾滋病病毒（HIV-1）感染者的抗Pj rMsg IgG和IgM抗体的检出率。方法以临床获得的Pj脱氧核糖核酸（DNA）为模板,扩增主要表面糖蛋白基因的5’端350bp片段,将聚合酶链反应（PCR）产物克隆到原核表达载体pGEX-3X中,获得可溶GST标签的rMsg,建立ELISA方法,检测北京佑安医院176例HIV-1感染者的血清标本,统计抗Pj rMsg IgG和IgM抗体的检出率。结果 176例HIV-1感染者中,抗Pj rMsg IgG和IgM抗体检出率分别为24.4%（43/176）和12.5%（22/176）,其中IgG阳性IgM阳性、IgG阳性IgM阴性、IgG阴性IgM阳性和IgG阴性IgM阴性的检出率,分别为7.4%（13/176）、17.0%（30/176）、5.1%（9/176）和70.5%（124/176）。抗体调查年龄分组中,（20~29）岁、（30~39）岁和40岁以上年龄组的IgG抗体阳性率分别为19.2%（10/52）、32.1%（25/78）和17.4%（8/46）,组间比较差异无统计学意义（x^2=4.450,P=0.108）;IgM阳性率分别为11.5%（6/52）、12.8%（10/78）和13.0%（6/46）,组间比较差异无统计学意义（x^2=0.064,P=0.969）。CD＋4T淋巴细胞计数分组中,≥350个/μL组和〈350个/μL组的IgG抗体阳性率分别为24.4%（30/123）和24.5%（13/53）,两组比较差异无统计学意义（x^2=0.000,P=0.984）;IgM抗体阳性率分别为12.2%（15/123）和13.2%（7/53）,两组比较差异无统计学意义（x^2=0.035,P=0.852）。抗Pj rMsg IgM抗体阳性的22例HIV-1感染者,临床没有肺炎的症状与体征。结论 HIV-1感染人群中抗Pj rMsg IgG和IgM抗体检出率分别为24.4%和12.5%,该人群感染Pj的血清学证据,抗Pj rMsg IgG或IgM阳性的检出率为29.5%。抗Pj rMsg IgM抗体阳性不能作为Pj现症感染的指标。

microRNA沉默卡氏肺孢子菌主要表面糖蛋白基因对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎的治疗作用

目的探讨靶向卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii,PC)主要表面糖蛋白基因(Major surface glycoprotein gene,MSG)上游保守序列(Upstream conserved sequence,UCS)的microRNA重组质粒对大鼠卡氏肺孢子菌肺炎(Pneumocystis cariniipneumonia,PCP)的治疗作用。方法将SD大鼠经腹股沟皮下注射地塞米松磷酸钠7周,制备大鼠PCP感染模型。将模型大鼠随机分为5组:microRNA重组质粒治疗组(M组)、磺胺药物治疗组(H组)、生理盐水对照组(C1组)、空载体质粒对照组(C2组)和模型对照组(C3组),其中M组和C1、C2组经尾静脉分别注射含microRNA重组质粒pPC-UCS、生理盐水和空载体,H组用磺胺药物灌胃治疗,C3组不做处理,每日1次,疗程为7 d。1周后吉姆萨染色,油镜下计数大鼠肺组织液印片中PC包囊数;HE染色,光镜观察肺组织病理改变;ELISA法检测大鼠血清中IL-10和IFNγ的表达水平;RT-PCR法检测肺组织中PC MSG-UCSmRNA的表达水平;电镜观察PC的超微结构。结果与C1、C2和C3组相比,M组和H组大鼠肺组织PC包囊数均明显减少(P<0.05),肺组织炎症较轻,大鼠血清IL-10的表达水平均显著降低(P<0.05),而IFNγ的表达水平显著升高(P<0.05),大鼠肺组织PC MSG-UCS mRNA的表达水平均显著降低(P<0.05);电镜观察显示,M组和H组PC包囊表面均出现破损,C1、C2、C3组未发现破损。结论 microRNA重组质粒pPC-UCS对大鼠PCP有明显的治疗作用,为治疗PCP提供了新的思路。

耶氏肺孢子菌与宿主免疫防御相互作用

肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)是由酵母样真菌耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)引起的肺炎,是免疫缺陷患者重要的致死原因。Pj一般不导致系统性感染,仅在肺部繁殖,引发严重损害肺换气功能的间质性肺炎。Pj通过主要表面糖蛋白(major surface glycoprotein,MSG)的抗原转换,逃避宿主免疫系统清除,而宿主利用dectin-1识别β-(1,3)-D-葡聚糖(beta-1,3-D-glucan,BG)、甘露糖受体识别MSG,启动天然免疫反应,继而CD4+T细胞聚集活化,调控细胞免疫和体液免疫。分泌干扰素γ的细胞毒型CD8+Tc1细胞有助于控制Pj感染,特异性抗体有助于调理加强吞噬细胞清除Pj,而聚集的中性粒细胞和非Tc1CD8+T细胞与肺损伤有关。血浆BG水平可以辅助诊断PCP,而支气管肺泡灌洗液中白介素8的水平与肺损伤及死亡预后有关。

抗耶氏肺孢子菌合成抗原IgG和IgM及IgA抗体水平调查

目的利用北京地区随机人群,抗耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii,Pj）人工合成主要表面糖蛋白（Re-combinant major surface glycoprotein）,调查抗Pjr Msg、Ig G、Ig M和Ig A抗体水平,探讨人群感染Pj情况。方法利用原核表达的Pj r Msg可溶抗原,建立酶联免疫吸附试验,调查266例北京地区随机人群血清抗Pj r Msg Ig G、Ig M和Ig A抗体的检出情况。结果北京地区266例随机血清,抗Pj r Msg Ig G、Ig M和Ig A抗体检出率分别为42.5%（113/266）,41.7%（111/266）和0（0/266）。其中同期Ig G阳性Ig M阳性、Ig G阳性Ig M阴性、Ig G阴性Ig M阳性和Ig G阴性Ig M阴性的检出率分别为17.3%（46/266）、25.2%（67/266）、24.4%（65/266）和33.1%（88/266）。40-50岁组的抗Pj r Msg Ig M抗体检出率为62.8%（59/94）,分别高于20-29岁组的32.9%（28/85）（χ2=15.895,P=0.000）和30-39岁组的27.6%（24/87）（χ2=22.522,P=0.000）。结论北京地区成人抗Pj r Msg Ig G与Ig M抗体阳性率分别为42.5%和41.7%,人群感染Pj后的Ig G或Ig M抗体阳性率高达66.9%,Ig A抗体没有检出以及Ig M抗体在高年龄组中检出率高的原因需要进一步研究。

14岁以下儿童抗耶氏肺孢子菌合成抗原IgG和IgM抗体的调查

目的 调查北京地区14岁以下人群,抗耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii,Pj）人工合成主要表面糖蛋白（Recombinant major surface glycoprotein,rMsg）IgG和IgM抗体检出率,探讨Pj在该人群中感染和流行情况.方法 利用原核表达的Pj rMsg可溶抗原,建立酶联免疫吸附试验,随机收集201例北京地区14岁以下人群血清,分析其抗Pj rMsg IgG和IgM抗体的检出情况.结果 收集病例按年龄分为3组,分别为出生日龄1 ～30 d 78例、出生1～12月龄33例、出生年龄1～14岁90例,3组人群中抗Pj rMsg IgG抗体检出率分别为10.3％ （8/78）,21.2％ （7/33）和41.1％（37/90）,组间比较x2 =21.190,P =0.000;抗Pj rMsg IgM抗体检出率分别为6.4％ （5/78）,39.4％（13/33）和76.7％（69/90）,组间比较x2=84.260,P=0.000.人群IgG和IgM抗体总体检出率为25.9％（52/201）和43.3％（87/201）（x2=53.463,P=0.000）.同一份血清中IgG阳性IgM阳性、IgG阳性IgM阴性、IgG阴性IgM阳性和IgG阴性IgM阴性的检出率分别为22.4％ （45/201）、3.5％（7/201）、20.9％ （42/201）和53.2％（107/201）.结论 北京地区14岁以下人群抗Pj rMsg IgG或IgM抗体总体检出阳性率为46.8％,阳性率随着出生后年龄的增加而逐渐增加.

耶氏肺孢子菌合成抗原在不同人群抗体筛查中的应用

耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii,Pj)是引起肺孢子菌肺炎(Pneumocystis pneumonia,PCP)的真菌类病原体,是免疫功能缺陷者重要的条件致病菌。Pj通过主要表面糖蛋白(Major surface glycoprotein,Msg)的抗原转换,逃避宿主免疫清除。MsgA,MsgB,MsgC1以及MsgC1的3个变种MsgC3,MsgC8和MsgC9是三组跨越Msg基因全长的原核表达重组肽段。对健康人群调查发现,84%的个体抗MsgA、MsgB或MsgC1 IgG抗体阳性。与健康对照相比,HIV感染者抗MsgC1 IgG抗体水平明显增高,而抗MsgA、MsgB IgG抗体水平没有变化。与非暴露组相比,职业暴露组医务人员的抗MsgC1 IgG抗体水平也明显增高,而抗MsgA、MsgB IgG抗体水平没有变化。因此,MsgC1抗体水平增高可以作为近期暴露过Pj的指标,对免疫缺陷者具有辅助诊断PCP的临床意义。Pj血清学研究的发展将会带来更大的PCP临床诊断和流行病学调查价值。

肺孢子菌肺炎辅助诊断方法研究进展

肺孢子菌肺炎是AIDS、器官移植受者、抗肿瘤放、化疗等各类继发或原发性免疫机能低下人群最常见的机会感染性疾病。通过显微镜检发现肺孢子菌是诊断肺孢子菌肺炎的金标准。但是,由于肺孢子菌主要寄生于肺泡腔内,目前临床采用的病原学检测方法或受到创伤性取材方法的限制或受病原体检出率极低的困惑。而目前盛行的基因检测方法因其操作过程的复杂及昂贵的费用难以适应临床应用。探索和建立敏感、特异的、可以从非创伤性标本中诊断肺孢子菌肺炎的快速诊断方法为临床之急需。学者们对肺孢子菌的主要表面糖蛋白及葡聚糖等菌体组分及其抗体等的检测方法进行了不断的探索,取得了一定进展。我们就该领域的研究进展及其在肺孢子菌肺炎辅助诊断方面的意义进行了综述。