性别特异分子标记在斑鳢全雄育种上的应用

为了快速筛选培育出全雄斑鳢,本研究结合性别特异分子标记和三系配套育种技术,开发了全雄斑鳢的育种方法。将健康的七日龄斑鳢幼鱼随机分成3组进行雌化处理,在饲料中分别添加雌二醇(E2)100、300、600 mg/kg,饲养60 d。利用性别特异分子标记引物M12、P2鉴定筛选出决定型为XY型斑鳢,将XY型正常雄鱼与XY型伪雌鱼交配,获得的子代分为两组,一组为投喂正常饲料,另一组进行雌激素投喂,利用MX1和MX3引物筛选出YY超雄鱼,最后将YY超雄鱼和正常雌鱼作为亲本交配生产出全雄斑鳢子代。结果显示,600 mg/kg激素浓度组的性逆转率最高,达75%,从508尾经雌激素E2投喂的家系中筛选获得235尾具有XY基因型斑鳢。XY伪雌鱼与正常雄鱼交配获得的子代在2月龄时检测到22尾YY超雄鱼,7月龄时检测到14尾YY超雄鱼,筛选获得YY超雄鱼个体用于生产全雄子代。本研究方法显著提高了全雄化斑鳢育种效率,缩短了育种周期,展现出巨大的经济潜力和应用价值,为其他鱼类开展性别特别分子标记辅助育种提供借鉴或参考。

斑鳢、乌鳢及其杂交种形态差异分析

运用形态学和框架分析法对斑鳢(♀)、乌鳢(♂)及其杂交种的形态差异和判别进行了分析。在体色方面,头顶部、体侧及尾鳍基部,斑鳢与乌鳢的体色斑纹差异明显,杂交鳢偏向于斑鳢。在11项可数性状中,三者腹鳍一致,杂交鳢胸鳍超父本偏离,其他可数性状介于两者之间,平均杂交指数为53.45。对可数性状卡方检验结果表明:斑鳢与乌鳢除胸鳍无差异外,均达差异显著或极显著;杂交鳢与乌鳢在尾鳍、鳃耙、侧线鳞和侧线下鳞无差异,其他则差异极显著;杂交鳢与斑鳢除尾鳍和鳃耙无差异外,其他差异显著或极显著。可数性状中背鳍条数、侧线鳞和侧线上鳞可作为初步判断三者所属的指标。对10项可量性状参数计算的杂交指数显示,杂交鳢可量性状偏父本(乌鳢)遗传,其平均杂交指数为73.90。可量性状数据和框架数据的聚类分析、判别分析和主成分分析显示,三者形态差异明显,杂交鳢在体型上偏向于乌鳢。判别分析建立的判别公式可以有效区分三者,判别准确率达100%。

乌鳢、斑鳢及其杂交F_1代肌肉营养成分和含肉率的比较分析

为了进一步研究杂交鳢的经济性状和杂交优势,采用常规生化分析方法,测定乌鳢Channa argus、斑鳢C.maculata、乌斑鳢C.argus♀×C.maculata♂和斑乌鳢C.maculata♀×C.argus♂的含肉率及肌肉营养成分,对其营养价值进行比较分析,并评价了其肌肉品质。结果表明：乌鳢、斑鳢、乌斑鳢、斑乌鳢平均含肉率分别为68.24%、71.34%、70.71%、70.18%;乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢粗蛋白质含量为20.6%~21.4%,粗灰分含量为1.2%~1.5%,水分含量为76.1%~76.7%,脂肪含量〈1.7%;必需氨基酸含量占氨基酸总量的49.40%~49.65%,鲜味氨基酸含量占氨基酸总量的38.35%~38.87%,其中乌斑鳢的必需氨基酸指数（EAAI）和鲜味氨基酸含量均高于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。研究表明,乌鳢、斑鳢、乌斑鳢和斑乌鳢肌肉中蛋白质含量均较高,脂肪含量较低,氨基酸种类齐全,必需氨基酸与鲜味氨基酸含量较高,乌斑鳢蛋白质营养水平与乌鳢、斑鳢和斑乌鳢相当,但其蛋白质氨基酸水平所体现的肌肉品质则优于乌鳢、斑鳢和斑乌鳢。

斑鳢、乌鳢及其杂交种遗传差异的AFLP分析

本文采用AFLP分子标记技术对斑鳢、乌鳢和杂交鳢(斑鳢(母本)与乌鳢(父本))共85个个体(其中斑鳢、乌鳢各30个,杂交鳢25个)进行了遗传差异分析。结果表明11对引物组合共检出了459个不同的扩增片段,扩增出的多态谱带数350条,多态性比例为76.25%,平均每对引物组合扩增出31.8条多态条带。乌鳢与斑鳢种群间存在稳定的、可以简单地借以进行群体鉴别的标记条带169条,其中父本(乌鳢)特异性条带78条,72条能够稳定地遗传给杂交鳢;母本(斑鳢)特异性条带89条,71条能够稳定地遗传给杂交鳢。杂交鳢另外出现了3条非双亲的条带。遗传差异的分子方差分析结果发现,斑鳢与乌鳢种群间的遗传相似度为0.5161,杂交鳢与斑鳢和乌鳢种群间的遗传相似度相近,分别为0.7189和0.7476,斑鳢与乌鳢之间以及杂交鳢与斑鳢和乌鳢之间的种群间遗传距离分别为0.6615、0.3300和0.2909,即AMOVA分析显示斑鳢、乌鳢和杂交鳢间存在极显著的遗传分化。UPGMA聚类分析显示,在个体间,斑鳢与乌鳢能区分成两大类,杂交鳢则分散于斑鳢和乌鳢种群中;在群体间,杂交鳢首先与乌鳢聚类,然后与斑鳢相聚,表明杂交鳢种群总体上更偏向于父本乌鳢。研究结果表明,杂交鳢与斑鳢和乌鳢发生混杂的可能性很大,应该对杂交鳢进行隔离养殖。本文结果将为斑鳢、乌鳢和杂交鳢的遗传分析提供实验依据,也为其种质的合理利用提供参考。

乌鳢、斑鳢及杂交种养殖研究现状

以乌鳢和斑鳢为亲本,正反交得到杂交子代:斑乌鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)或乌斑鳢(乌鳢♀×斑鳢♂)。与父母本相比,杂交子代具有优良的性状,在成活率、抗逆性、生长速度等性状上均得到了改良,在养殖中得到推广。概述了乌鳢、斑鳢及杂交鳢的养殖研究现状,指出了养殖过程中存在的问题,并对杂交鳢养殖进行展望。

基于RNA-seq技术对乌鳢和斑鳢肝脏的转录组分析

为满足标记辅助育种的要求,通过Illumina Solexa测序平台首次开展了乌鳢和斑鳢肝脏转录组测序。结果表明:乌鳢和斑鳢样本中分别得到85 802个和52 769个转录本,大小分别为113.75 Mb和44.29 Mb,组装后分别得到59 959个和44 337个Unigene,大小分别为45 Mb和27 Mb,序列平均长度为751.99 bp和608.88 bp。基因功能注释研究共获取了26 284个和24 812个特异蛋白,根据特异蛋白注释结果进行GO分析,分别有20 682和21 752条Unigene有GO注释;采用GO功能分类工具可将已注释转录物序列划分为分子功能、生物途径和细胞成分3类,为下一步开展生长等性状相关基因功能验证研究以及分子标记辅助育种等提供了丰富的序列资源。

乌鳢和斑鳢EST序列微卫星信息分析

乌鳢（Channa argus,♂）、斑鳢（Channa maculatus,♀）是杂交鳢＂杭鳢1号＂的亲本。利用高通量测序技术对乌鳢和斑鳢的肝脏进行转录组测序获得大量EST序列后,利用MISA软件进行微卫星信息分析,结果表明,通过转录组测序获得乌鳢EST序列59 959条,长度45 mb,发现15 428个SSR,出现频率为25.73%;获得斑鳢EST序列44 337条,长度27 mb,发现8 439个SSR,出现频率为19.03%。在乌鳢和斑鳢EST-SSR中,重复单元以1～2碱基重复为最多,并以长度小于16 bp的短重复序列为主,间隔SSR和复合SSR的EST序列RPKM均值要低于单纯型SSR的EST序列RPKM均值,且在单纯型SSR中SSR长度越长,其RPKM均值则越低。

月鳢、乌鳢和斑鳢血液指标、血细胞比较分析

对月鳢、乌鳢和斑鳢3种鱼的血液指标(血细胞数、血红蛋白值、血细胞比容)、血红细胞大小(红细胞和细胞核的长、短径值)及其外周血红细胞周期进行了比较分析。结果表明,血细胞数量依次为斑鳢>乌鳢>月鳢;血红蛋白含量和血细胞比容依次为月鳢>乌鳢>斑鳢;红细胞大小依次为月鳢>乌鳢>斑鳢。并且这3种鱼外周血细胞都有处于DNA合成期(S)、DNA合成后期(G2)和分裂期(M)的细胞,表明这3种鱼类的外周血红细胞没有失去分裂能力的特化细胞群,表现出了较强的细胞周期现象;在红细胞分裂能力上,其分裂能力依次为乌鳢>斑鳢>月鳢。

杂交鳢(乌鳢♂×斑鳢♀)及其亲本血液指标的比较分析

本研究采用血细胞分析仪、流式细胞仪和血涂片制作方法,对杂交鳢及其亲本血液指标进行了比较分析。结果显示,杂交鳢(Channa argus♂×C.maculata♀)与其亲本相比,表现出明显杂种优势:在血液红细胞数目、白细胞数目、血红蛋白含量和血细胞比容上,杂交鳢都比亲本高,差异显著(P<0.05);在红细胞体积上,杂交鳢均比亲本小,差异显著(P<0.05);杂交鳢及其亲本血液中都含有较少比例的DNA合成期(S期)细胞,但彼此差异不显著(P>0.05)。

乌鳢、斑鳢及杂交种耗氧率与窒息点的初步研究

对乌鳢、斑鳢及其正反交杂交种(斑乌鳢和乌斑鳢)的耗氧率和窒息点进行了初步研究。结果显示:在水温25.1℃条件下,平均体重48.88 g的乌鳢、45.30 g的斑鳢、44.20 g的斑乌鳢和46.76 g的乌斑鳢的耗氧率分别为0.22、0.16、0.19、0.17 mg/g.h,窒息点分别为2.47、1.45、1.18、2.01 mg/L。并分析了这4种鱼耗氧率的昼夜变化规律以及窒息点的差异原因,讨论了4种鱼窒息点高于其他常见鱼的可能性。

乌鳢养殖技术之一 雄性乌鳢与雌性斑鳢杂交试验

乌鳢（Channa argus）和斑鳢（C．maculata）属于鲈形目、攀鲈亚目、鳢科、鳢属。杂交鳢是以乌鳢为父本、斑鳢为母本，通过杂交获得的子一代，具有明显的杂种优势，在生产上表现出生长速度快、抗逆性强、产量高、易驯食人工配合饲料、便于开展规模化养殖等优点，在珠三角地区已取代乌鳢和斑鳢而成为鳢科鱼类中最主要的养殖品种，然而由于人工繁殖和苗种培育技术不成熟，难以稳定、规模化地提供优质苗种，制约了养殖的健康快速发展。

斑鳢与乌鳢杂交及回交子代生长和免疫指标的比较研究

为选育出成活率高、生长速度快、抗病能力强、饲料利用率高的鳢,以乌鳢Channa argus(A)、斑鳢Channa maculate(M)和杂交鳢(乌鳢♂×斑鳢♀,MA)各自进行自交、反交和回交繁殖出的9种鳢为试验对象,养殖90 d后,比较了9种鳢的生长、免疫和消化指标。结果表明:(1)在生长方面,斑鳢的自交组合(MM)存活率为82.33%,显著优于其他组合(P<0.05);杂交组合MA(斑鳢♀×乌鳢♂)和MM的总增重分别为8908、8732 g,明显高于其他组合;MA的特定生长率为0.84%/d,明显高于其他组合;乌鳢的自交组合(AA)、MM和杂交组合AM(乌鳢♀×斑鳢♂)的饵料系数分别为1.22、1.22、1.31,显著低于其他组合(P<0.05)。(2)在免疫方面,MA和AM的酸性磷酸酶(ACP)活性分别为1.637 2、1.613 8 U/m L,高于其他组合;AA、AM和MA的超氧化物歧化酶(SOD)活性分别为163.10、159.09、155.03 U/m L,高于其他组合;AA和MA的丙二醛(MDA)含量分别为7.47、7.48 nmol/m L,低于其他组合;MA和MM的谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性分别为443.99、410.45 U/L,高于其他组合;而溶菌酶(LZM)和羟自由基(hydroxy radicl)含量各组之间均无显著性差异(P>0.05)。综合考虑9种组合鳢的生长性能和免疫指标,发现乌鳢与斑鳢杂交组优于其自交组,自交组优于杂交鳢的回交组和自交组,其中,最符合选育目标的是MA,适宜大面积推广。

呋喃唑酮代谢物在杂交鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)体内的残留消除规律

近几年中国农业部监督抽查的结果显示，硝基呋喃类残留仍是养殖水产品中检出率较高的隐患之一。由于缺乏硝基呋喃在养殖动物体内蓄积和残留消除规律等基础数据，不能明确药物残留的具体来源和时间，使管理者在决策中缺乏依据，难以明确监管和执法的重点。在模拟自然养殖条件下，研究了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮（AOZ）在杂交鳢（斑鳢Channa maculata♀×乌鳢Channaargus♂）体内的残留及消除规律。在35±2．5℃水温条件下，对杂交鳢苗种按2％体重的量投喂含3％0呋喃唑酮的药饵，每天投喂3次，连续投喂5d。从投喂开始于0．5、1、2、4、8、12、24、48、96、192、288、384、480、720、960、1200、1440、1920、2400、2880、3600h取样，采用液质联用（HPLC-MS）方法测定肌肉中AOZ的含量。结果表明，从给药开始0．5-24h，肌肉中AOZ含量从800．18±8．45μg/kg逐渐升高至5686．65±11．16IXg／kg；在48～96h，肌肉中的AOZ残留量变化不大，维持在5420．65±10．81至5390．08±7．24μg/kg之间；停止给药后2880h（120d）低于检测限0．5μg/kg。结果表明，由于呋喃唑酮在杂交鳢体内的代谢时间较长，建议政府及相关部门加大对该种禁用药物的监督抽查力度。

斑鳢(♀)×乌鳢(♂)不同组合F_1代养殖性能分析

用同一广东群体斑鳢(Channa maculate)和4个不同地理群体乌鳢(C.argus)杂交,建立4个杂交组合:广东斑鳢♀×山东乌鳢♂(SG)、广东斑鳢♀×浙江乌鳢♂(ZG)、广东斑鳢♀×江西乌鳢♂(JG)和广东斑鳢♀×湖南乌鳢♂(HG)。将它们的F1代鱼苗根据不同阶段,分别饲养在规格为6 m×2 m(长×宽)小水泥池和6 m×5.5 m(长×宽)大水泥池中,将它们的F1代鱼种通过荧光标记后混养在规格为3 m×3 m×1.4 m(长×宽×高)网箱中。对各组合F1代的生长性能和养殖效果进行比较,结果表明:广东斑鳢♀×山东乌鳢♂(SG)组合F1代的养殖效果最好,体重、体长增加量最大,分别为582.54 g和34.80 cm。且生长速度最快,平均起捕规格582.54 g和平均产量38.83(100 g/m2),均显著大于其余3个组合的F1代。

斑鳢与乌鳢血液生理生化指标的比较分析

采用K-4500型血细胞分析仪和OLympus Au400生化分析仪及参照人的血液性状分析法,测得斑鳢的红细胞(3.27±0.54)1012/L比乌鳢(3.71±0.51)1012/L的低,平均红细胞体积(128.5±3.62)fl比乌鳢(124.05±3.06)fl的高。血红蛋白(148.7±9.33)g/L含量比乌鳢(115.0±7.25)g/L高,斑鳢的细胞脆性比乌鳢的小。生化指标中斑鳢除血糖含量比乌鳢大外,血清总蛋白含量(37.30±4.06)g/L、白蛋白含量(21.67±3.39)g/L、血清中甘油三酯的含量(0.53±0.06)mmol/L、胆固醇(4.37±0.68)mmol/L都比乌鳢低。分析表明斑鳢的活动性、抗病力比乌鳢的强。

闽香鳢〔乌鳢(♂)×斑鳢(♀)〕遗传生物学研究Ⅰ.子代和亲本形态比较

通过对闽香鳢〔乌鳢 (♂ )×斑鳢 (♀ )〕及其亲本的主要形态分类学鉴定指标进行测量和比较 ,发现闽香鳢的主要形态学性状介于亲本乌鳢和斑鳢之间 ,为中间类型 ,由此初步判断其为亲本的杂合体。并根据臀鳍、背鳍和侧线鳞数设计了鉴别分选图 。

乌鳢(♂)×斑鳢(♀)杂交繁育及杂交子一代生物学研究进展

杂交鳢是以乌鳢(Channa argus)为父本,斑鳢(C.maculata)为母本杂交获得的子一代,相比亲本,具有生长速度快、抗逆性强、成活率高、易驯食膨化颗粒饲料的优势。概括了近几年来国内外乌鳢(♂)×斑鳢(♀)杂交繁育历史、杂交繁育技术,同时对乌鳢(♂)×斑鳢(♀)杂交子一代的遗传特性、胚胎发育、生长性能、抗逆性、血液指标、肌肉营养成分等研究现状进行了总结。

低蛋白质饲料中补充必需氨基酸对斑鳢幼鱼生长性能、肌肉氨基酸组成、血浆生化指标及肝脏氨基酸代谢相关基因表达的影响

本试验旨在探究低蛋白质饲料中补充必需氨基酸对斑鳢幼鱼生长性能、肌肉氨基酸组成、血浆生化指标及肝脏氨基酸代谢相关基因表达的影响。试验随机选取540尾健康的斑鳢幼鱼,初始体重为(16.85±0.21)g,随机分为3个组,每组3个重复,每个重复60尾鱼。高蛋白质组(HP组,对照组)饲喂粗蛋白质水平为48%的高蛋白质饲料,低蛋白质组(LP组)饲喂粗蛋白质水平为42%的低蛋白质饲料,低蛋白质+必需氨基酸组(LP+EAA组)饲喂粗蛋白质水平为44%的低蛋白质+必需氨基酸(精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸和苏氨酸)饲料。试验期8周。结果表明:1)HP组和LP+EAA组的增重率和特定生长率显著高于LP组(P<0.05),饲料系数显著低于LP组(P<0.05)。LP组和LP+EAA组的氮沉积率显著高于HP组(P<0.05)。2)LP组的鱼体粗脂肪和干物质含量显著低于HP组和LP+EAA组(P<0.05)。LP+EAA组的肌肉缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸、总必需氨基酸和总氨基酸含量显著高于HP组和LP组(P<0.05),肌肉酪氨酸和甘氨酸含量显著高于HP组(P<0.05)。3)LP+EAA组的血浆尿素氮含量显著低于HP组(P<0.05),LP组的血浆高密度脂蛋白含量显著低于HP组和LP+EAA组(P<0.05),LP组的血浆谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性显著高于LP+EAA组(P<0.05)。4)LP组的肝脏中y+L型氨基酸转运体(y+LAT2)、雷帕霉素靶蛋白(TOR)、核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、小肽转运体1(PepT1)和增强结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA相对表达量显著低于HP组(P<0.05),肝脏中真核起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)和发育和DNA损伤反应调节蛋白1(REDD1)的mRNA相对表达量显著高于HP组(P<0.05);LP+EAA组的肝脏中PepT1和CHOP的mRNA相对表达量显著低于HP组(P<0.05)。5)肝脏组织学观察发现,LP组肝脏空泡化严重,而LP+EAA组肝脏形态正常。综上所述,饲料粗蛋白质水平从48%降低到42%并补充必需氨基酸,不影响斑鳢幼鱼的生长性能和饲料利用率,提高了肌肉必需氨基酸含量,维持了肝脏健康。

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢,采用PCR-RFLP技术,对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列,发现1处单核苷酸多态性位点,可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增,用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切,并用1.5%的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示,斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段,分别为315 bp和875 bp,乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。

杂交鳢(乌鳢♂×斑鳢♀)及其亲本血清胆红素和尿素氮的比较分析

本研究采用全自动生化分析仪,分别对杂交鳢及其亲本共3个群体中的血清总胆红素(TBILI)、直接胆红素(DBILI)和尿素氮(BUN)的浓度进行了测定。结果表明,在血清总胆红素的浓度比较上,统计分析显示杂交鳢和母本斑鳢无明显差异而与父本乌鳢有显著差异(P< 0.05),但在直接胆红素和血清尿素氮的浓度比较上,杂交鳢和父本乌鳢无明显差异而与母本斑鳢有显著差异(P < 0.05),说明在总胆红素上杂交鳢和母本的遗传性状相同而与父本有差异,而在直接胆红素和血清尿素氮上杂交鳢和父本的遗传性状相同而与母本有差异。