MiR-130c-5p靶向乌鳢水泡病毒g基因抑制病毒增殖

为了研究miR-130c-5p在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)感染中潜在靶基因g的靶向关系以及对病毒复制的影响,本研究以斑点叉尾鮰卵巢(channel catfish ovary,CCO)为实验材料,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)技术测定SHVV不同感染时间和感染剂量条件下,病毒基因水平和蛋白水平以及miR-130c-5p变化情况。此外,将SHVV的g基因上miR-130c-5p对应的靶序列克隆到质粒pmirGLO,构建质粒pmirGLO-G用于双荧光素酶报告实验进行靶基因验证。结果显示,随着SHVV感染时间及剂量的不断增加,miR-130c-5p和g基因的表达水平都显著上调。进一步实验证明,miR-130c-5p类似物和pmirGLO-G质粒共转染可显著抑制荧光素酶活性强度,而转染miR-130c-5p抑制剂则明显上调了pmirGLO-G报告载体的荧光信号。此外,miR-130c-5p的过表达显著降低了病毒g基因的mRNA及蛋白表达,而抑制miR-130c-5p的表达则上调了g基因的mRNA及蛋白的表达水平。研究结果表明,miR-130c-5p通过靶向SHVV的g基因,引起G蛋白的降解,从而抑制SHVV的增殖。本研究结果为理解microRNA调控SHVV的致病机制提供了重要基础,为抗SHVV疫苗等药物的研发提供了理论支持。

miRNA在乌鳢水泡病毒感染月鳢细胞(SSN-1)中的表达变化及其调控作用

为了探究microRNA(miRNA)对乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus, SHVV)感染月鳢细胞(striped snakehead cell, SSN-1)的影响,本研究对SHVV感染的SSN-1细胞及未感染的细胞进行miRNA高通量测序。分别用U6、β-actin和5S rRNA作为内参基因研究SHVV感染对细胞内22个高丰度(transcripts per million, TPM≥1 000) miRNA表达水平的影响,结果显示,U6基因作为内参时,SHVV感染对β-actin没有显著影响,但是5S rRNA显著上调表达,说明U6和β-actin基因适合作为内参基因研究SHVV感染对miRNA表达水平的影响。此外,我们研究了14种miRNA对SHVV增殖的影响。结果发现,miR-27a-3p、miR-26a-5p、miR-30e-3p等11种miRNA显著促进SHVV增殖,miR-150和miR-216b显著抑制SHVV增殖。进一步研究发现高丰度的miR-100-5p在SHVV感染SSN-1细胞早期上调表达,晚期下调表达。过表达miR-100-5p可以显著抑制SHVV的增殖,而抑制表达miR-100-5p可以显著促进SHVV的增殖。本研究为开发抗SHVV的核酸药物提供了理论基础。

乌鳢水泡病毒核蛋白和磷蛋白多克隆抗体的制备与应用

为体外表达乌鳢水泡病毒(Snakehead fish vesiculovirus,SHVV)核蛋白(Nucleoprotein,N)、磷蛋白(Phosphoprotein,P)及制备两种蛋白的多克隆抗体,采用分子克隆技术分别将乌鳢水泡病毒N、P基因序列转入pGEX-5x-1原核表达载体,成功构建重组表达质粒后转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞中诱导表达,将所表达的目的蛋白纯化回收后分别免疫新西兰大白兔和小鼠以制备多克隆抗体,采用Western-blot和ELISA检测抗体的特异性和效价,利用间接免疫荧光法检测病毒N、P蛋白在宿主细胞中的分布。结果表明,本研究成功构建了pGEX-5x-1-N和pGEX-5x-1-P重组表达质粒,在大肠杆菌表达系统中诱导表达了73 kD重组N蛋白和57 kD的重组P蛋白,获得了高效价的能特异性识别SHVV的N、P蛋白,抗乌鳢水泡病毒N、P蛋白的多克隆抗体。间接免疫荧光结果表明:乌鳢水泡病毒的N、P蛋白感染细胞后分布在细胞质内。实验所获得的具有免疫原性的抗血清在病毒诊断及病毒蛋白的功能研究中具有很好的应用潜力,可为建立该病毒的免疫学检测方法提供基础。

乌鳢水泡病毒L蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为研究L蛋白在乌鳢水泡病毒(snakehead vesiculovirus,SHVV)增殖过程中发挥的作用,扩增SHVV L基因的前900个碱基,将其克隆到载体pET-32a(+)中,构建原核表达质粒pET32a-L,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。设置不同温度、IPTG浓度及诱导时间,选择最佳的表达条件。通过NI-NTA亲和层析柱纯化蛋白,并利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。用Western blot鉴定抗体特异性,间接免疫荧光观察L蛋白在SHVV感染斑点叉尾鮰卵巢细胞(channel catfish ovary,CCO)中的定位情况。结果显示,纯化的L蛋白分子质量约42 ku,与预期大小相符。制备的L蛋白多克隆抗体可以与L蛋白发生特异性免疫反应,且L蛋白主要定位在细胞质,表明L蛋白多克隆抗体制备成功。