乏氧／辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因载体的构建及表达

目的:构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察乏氧和辐射对其表达的影响。方法:利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;pMD19T-Egr1经SacⅠ和HindⅢ双酶切得到Egr1;pshuttle-shTRAIL经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切得到shTRAIL;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确。肺腺癌A549细胞分为正常组、乏氧组(1%)、照射组(6 Gy)和乏氧加照射组;表达载体转染肺腺癌A549细胞,RT-PCR及ELISA法检测shTRAIL的表达。结果:BamHⅠ和SmaⅠ酶切,所得片段大小分别为1 284和4 998 bp、2 292和3 990 bp;以Egr1和shTRAIL引物PCR扩增该载体,得到469和820 bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧组、辐射组及乏氧加照射组shTRAIL mRNA和蛋白表达增加,与对照组比较差异有显著性(P<0.05),且乏氧加照射组表达更明显。结论:成功地构建了乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因表达的载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL;乏氧及照射能够诱导TRAIL表达增加,且二者具有协同作用。

乏氧／辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响

目的构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)(shTRAIL)基因表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察其对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响。方法利用化学合成HRE上、下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,MTT法检测A549细胞增殖的变化,流式细胞术检测A549细胞周期的变化。结果BamHI和SmaI酶切,所得片段大小分别为1284bp和4998bp、2292bp和3990bp;以载体为模板,Egr1和shTRAIL引物进行PCR扩增,可得到469bp和820bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧与辐射能够降低细胞增殖能力,增加G0/G1和S期细胞百分比,降低G2/M期细胞百分比(P<0.05,P<0.01),二者联合作用更明显。结论乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因在乏氧和/或辐射条件下能够延长细胞G0/G1和S期,缩短G2/M期,并且抑制肺腺癌A549细胞增殖能力,二者协同作用更明显。

乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因对肺腺癌A549细胞凋亡的影响

目的:构建乏氧(HRE)/辐射(Egr1)双敏感启动子介导的分泌型人TRAIL(shTRAIL)基因表达载体pcD-NA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,观察其对肺腺癌A549细胞周期及增殖的影响。方法:利用化学合成HRE上下链,PCR扩增得到双链HRE;利用基因重组技术构建含有HRE/Egr1双敏感启动子介导shTRAIL的表达载体pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL,经酶切、PCR和测序鉴定正确后,干扰质粒经脂质体介导转染肺腺癌A549细胞,利用流式细胞术和TUNEL检测细胞凋亡变化;利用蛋白质印迹法检测Caspase-3蛋白表达。结果:质粒大小为6282bp,BamHⅠ和SmaⅠ酶切,所得片段大小分别为1284和4998、2292和3990bp;以载体为模板,Egr1和shTRAIL引物进行PCR扩增,可得到469bp和820bp产物;将pcDNA3.1-HRE-Egr1-shTRAIL进行测序,所得结果与设计一致,说明构建正确。转染肺腺癌A549细胞后,乏氧与辐射能够增加细胞凋亡的百分比(P<0.05或P<0.01),两者联合,作用更明显,P<0.01;而且乏氧与辐射也能诱导Caspase-3表达的增强(P<0.05或P<0.01),两者联合作用,表达增加更明显,P<0.01。结论:乏氧/辐射双敏感启动子介导分泌型人TRAIL基因在乏氧和辐射条件下能够增加肺腺癌A549细胞的凋亡,诱导Caspase-3蛋白表达的增加,两者联合作用效果更明显。