鸡新城疫卵黄抗体IgY的分离提纯研究

本文对母鸡经鸡新城疫疫苗免疫接种后产生并富集在卵黄中的抗体IgY的提取纯化工艺条件进行了研究与优化,确定了去脂、提取抗体最佳工艺为:卵黄液用0.05mol/L,pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液1∶9倍稀释,搅拌15min,4℃静置10小时,抗体回收率为90%,去脂率为99%;该提取液用40%饱和度的硫酸铵盐析,得到的盐析液抗体回收率为82%,纯度达到69%。盐析液经截留分子量为100KD的有机陶瓷膜超滤后,截留液抗体回收率达到92%,纯度为85%。

抗乙型肝炎病毒免疫核糖核酸的制备及方法学研究

病毒性肝炎在临床上较为常见。但是在这几型肝炎中尤以乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）发病率最高，在体内存留时间过长，传染性强，治愈率低而倍受临床医生的重视。调查证实在我国ＨＢＶ的携带者约占正常人群的１２．５％左右。随着社会的发展和科技的进步，乙肝疫苗的出现对于早...

草鱼垂体生长激素分离纯化及其抗体制备的研究

应用碱性抽提、亲和层析、凝胶过滤和离子交换层析等技术从草鱼垂体中分离提纯出纯度高的 草鱼生长激素（ｇｃＧＨ）。用酶联免疫吸附测定法（ＥＬＩＳＡ）检测表明草鱼ＧＨ与大马哈鱼ＧＨ抗血清 具有明显的免疫交叉反应，而与大马哈鱼催乳素（ＰＲＬ）抗血清没有交叉反应，聚丙烯酰胺凝胶电 泳表明草鱼 ＧＨ为单一蛋白带，其分子量约为２２５００道尔顿；等电聚焦揭示出草鱼 ＧＨ主要由等电 点为４．７和５．０的两条蛋白带组成。用纯化的草鱼ＧＨ制备了其特异的兔抗血清。在ＥＬＩＳＡ测定中， 该抗血清与大马哈鱼ＧｔＨ及牛ＧＨ完全没有交叉反应，而与大马哈鱼ＧＨ只有当其浓度高达２ｕｇ／ ｍｌ时，才有微弱的交叉反应．草鱼 ＧＨ抗血清的效价确定为１： ４００００左右。应用草鱼 ＧＨ及其抗血清 建立了酶标受体测定法（ＥＬＩＳＡ－ＲＡ）并检测了草鱼ＧＨ的生物活性。结果表明，草鱼ＧＨ具有与草 鱼肝细胞ＧＨ受体特异结合的生物活性。免疫细胞化学研究表明草鱼ＧＨ抗血清只与草鱼垂体间 叶（ＰＰＤ）的生长激素分泌细胞特异结合，而与前叶（ＲＰＤ）及后叶（ＰＩ）细胞均无染色反应。

苯二氮卓受体的提纯及受体亚基单克隆抗体的制备

用不实验室建立的亲和层析系统成功地址猪脑分离纯化了苯二氮卓受体（ＢＺ－Ｒ）。结合试验显示，纯化的ＢＺ－Ｒ和专一配基最大的结合容量为１９７０ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白，解离常数Ｋｄ值为５．７ｌｎｍｏｌ／Ｌ，圆盘电泳和等电聚焦电泳均显示出单一区带。纯化受体经ＳＤＳ一聚丙烯酰胺不连续电泳，可分离出分子量分别为５９ｋｕ、５６ｋｕ、５１ｋｕ、４８ｋｕ和３８ｋｕ的５条区带。用这些区带蛋白免疫动物，得到了３种单克隆抗体，酶联免疫检测显示，它们和纯化受体结合的最大滴度分别为１：３００００，１：２２０００，１：２２０００．免疫印迹显示，３种单克隆抗体分别和５９ｋｕ、５６ｋｕ、５１ｋｕ的亚基结合，显示出单一清晰的反应带。以上结果说明，我室建立的ＢＺ－Ｒ亲和层析系统是一个稳定、重复性好的受体纯化系统。纯化的ＢＺ－Ｒ对专一配基有根高的亲和力并达到较高的纯度。纯化的ＢＺ－Ｒ最少由４个亚基组成。制备的３种单克隆抗体有一定效价及很高的特异性。

双水相萃取系统用于禽卵黄抗体提纯的研究

以鸡法氏囊油乳剂抗原免疫健康鸡群，收集高免蛋黄，利用聚乙二醇双水相尊取系统（PEG6000）从印黄中快速分离纯化特异性抗体。采用琼脂免疫扩散法检测其平均效价，醋酸纤维膜电泳法测其纯度，Coomassil亮蓝法测蛋白浓度。结果表明：本法具有IgG浓度高，操作简便、快速、经济，适于批量化生产的优点。

一种快速分离提纯iRNA的新方法

免疫核糖核酸(immuno ribonucleicacid,iRNA)属mRNA,没有种属特异性,可超越种属界限传递特异性免疫活性。这种免疫应答能力的传递既包括体液免疫,又包括细胞免疫。实验证明,在体液免疫方面,iRNA无论在体内还是在体外均能诱导特异性抗体的产生,形成免疫记忆。在细胞免疫方面,iRNA能够增强巨噬细胞的吞噬、杀抑细菌的功能,而且还能诱导干扰素等重要淋巴因子的产生。因此说iRNA具有强免疫活性,可用于多种疾病的治疗。

单克隆抗体亲合层析法快速提纯乙肝表面抗原

用乙型肝炎病毒单克隆抗体(抗-HBsMcAb)与活化琼脂糖(MinileakLow)结合制备亲合层析柱,用于提纯乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)。对纯化前后的表面抗原活性用RPHA法进行了检测,提纯后的效价比提纯前提高了20多倍。用免疫电镜(IEM)对提纯物观察可见满视野22mm的小园颗粒。经SDS-PAGE电泳得出一条较清楚的带。

角膜内皮抗原及其抗体的提纯

目的 :提纯角膜内皮抗原 (cornealendothelialanti gen ,CEN Ag)及抗角膜内皮抗原抗体 (anti cornealendothelialantibody ,ACEN Ab) ,为角膜移植排斥反应的理论研究提供基础。方法 :用猪角膜内皮做抗原 ,上皮做对照。经离子交换层析及 2B4 .14 .1单克隆抗体亲和层析制得纯化的CEN Ag和角膜上皮抗原 (cornealepithelialantigen ,CEP Ag)。用提纯的CEN Ag和CEP Ag分别免疫家兔 ,取血清经亲和层析得到ACEN Ab和抗角膜上皮抗原抗体 (anti cornealepithelialanti body,ACEP Ab)。结果 :经聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)分析 ,抗原分子质量分别为 4 3kD和 5 3kD ,相应的免疫球蛋白是IgG2 和IgG3 。结论 :CEN Ag和ACEN Ab可以被提纯并从理论上证明 。

分泌抗丙型肝炎病毒NS_5蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立能稳定分泌抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ５重组蛋白单克隆抗体（ＭｃＡｂ），并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法用重组ＨＣＶＮＳ５区蛋白为抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与骨髓瘤细胞ＳＰ２／０进行融合，经有限稀释克隆３次后制备分泌ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株，并用酶免疫（ＥＩＡ）法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果融合后的阳性克隆中筛选出６株能稳定分泌ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞株，命名为２Ｃ８，２Ｄ２，１Ｄ６，２Ｇ２，１Ｆ５和１Ｆ１０。这６株ＭｃＡｂ与ＮＳ５重组抗原均有良好的反应性，杂交瘤培养上清的ＥＩＡ抗体滴度为１∶４００～１∶１６００，其中１株诱生的同系小鼠腹水滴度为１∶８００００。这６株ＭｃＡｂ均为ＩｇＧ１亚型。结论该ＭｃＡｂ的制备，可为ＨＣＶ感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。

谈谈乙型肝炎免疫球蛋白

乙型肝炎免疫球蛋白,简称乙肝免疫球蛋白(HBIG),是经过免疫正常献血员后采集含有较高滴度的抗—HBs血浆,再用低温乙醇方法提纯而制得的浓缩血液制剂。乙型肝炎表面抗体效价在1:20万～50万(PHA法)或200国际单位以上的又称为高效价乙型肝炎免疫球蛋白。目前使用的制剂每支1毫升,含200国际单位的乙肝免疫球蛋白。 由于乙肝免疫球蛋白是用人血作原料,来源困难,价格昂贵,所以只用于意外事故。

肾上腺素能β1受体亚型特异性抗体的制备及鉴定

【目的】制备和鉴定 β1受体亚型特异性抗体。【方法】人工合成 β1受体细胞膜外第二环 197 2 2 2位氨基酸序列作为抗原。连接钥孔冒贝血蓝蛋白 (KLH)增加抗原性后免疫兔获得抗血清。通过凝胶双扩散实验和ELISA法鉴定其效价 ;通过免疫荧光法及ELISA法鉴定其特异性 ;通过离体蛙心灌流实验鉴定其药理活性。【结果】该抗血清效价高 (分别为 1∶6 4和 1∶10 6)、特异性强 ,能和心肌 β1受体发生特异性结合 (1∶10 4 ～ 1∶10 5) ,为异丙肾上腺素的非竞争性拮抗剂。 (pD2 ′ =1 6 2 )。【结论】成功制备的 β1受体亚型特异性抗体可能成为进一步研究 β1受体分布、功能和定量的有力工具。

牛肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区1的分离纯化及其在抗肾小球基底膜相关疾病中的应用(英文)

目的 :分离纯化抗肾小球基底膜 (GBM)抗体的特异性靶抗原 ,并评价其在抗GBM抗体检测中的应用价值。方法 :通过孔径不同的筛网从牛肾脏中提取牛肾小球 ,采用改良的 4 0g·L-1去氧胆酸钠破坏肾小球细胞而获得GBM ,经胶原酶消化后收集可溶性牛GBM粗抗原。在 pH 7.5的条件下经MonoQ阴离子交换层析柱分离纯化肾小球基底膜Ⅳ型胶原α链非胶原区 1[α(Ⅳ )NC1],并经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳和Westernblot鉴定其纯度及活性。应用 2mg·L-1纯化的牛α(Ⅳ )NC1包被酶标板 ,建立牛α(Ⅳ )NC1-ELISA方法检测血清中抗GBM抗体 ,并与经典的以人GBM可溶性蛋白为粗抗原的ELISA法进行对照研究。血清来自 90例已知抗人GBM抗体阳性的患者、10 0例正常人和 5 0例其他肾脏疾病患者。对两种方法进行相关分析并计算牛α(Ⅳ )NC1-ELISA的敏感性、特异性。结果 :纯化的牛α(Ⅳ )NC1经SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳表现为相对分子质量为 2 5× 10 3 和 5 0× 10 3的蛋白并可被抗GBM抗体阳性血清所识别 ;应用牛α(Ⅳ )NC1-ELISA法检测抗GBM抗体的敏感性和特异性分别为 10 0 %和 98% ,与人GBM粗抗原 -ELISA的相关性为 0 .6。结论 :应用改良的去氧胆酸钠方法破坏肾小球内细胞并进一步经MonoQ离子交换柱分离纯化牛α(Ⅳ )NC1,可以得到高纯度?

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶因子单克隆抗体的制备

目的：制备从尖吻蝮蛇蛇毒中分离的纤溶因子的单克隆抗体，为克隆基因提供特异性的探针。方法：将纤溶因子免疫Ｂａｌｂ／Ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌抗体的细胞株。采用血纤维蛋白平板法，观察单克隆抗体能否抑制纤溶因子的纤溶作用。结果：获得２株稳定分泌单克隆抗体的细胞株。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹显示该单克隆抗体能特异地与纤溶因子结合，与其它蛋白无交叉反应，此外，这２株单克隆抗体具有抑制纤溶因子溶解人血纤维蛋白的作用。结论：这２株抗体不仅能特异地与纤溶因子结合，而且具有抑制纤溶的作用，为克隆纤溶因子基因及其功能表达提供了特异性的研究工具。

特异性抗肝癌单链抗体的优化表达与纯化及其生物学活性鉴定

目的:制备有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法:以ITPG诱导大肠埃希菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap抗ETag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性。结果:在培养基中加入0.4mol/L蔗糖,以IPTG1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325mg/L,相对分子质量为29×103。与肝癌细胞结合效价为1:64,与肝癌组织结合阳性率为75%,具有良好的生物学活性。结论:成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。

ARMET的原核表达及其单克隆抗体的制备

目的制备抗人ARMET(arginine-rich,mutated in early stage of tumors)的单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性。方法将pET28a-ARMET转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,用预装好的Ni-beads柱进行纯化,通过SDS-PAGE电泳及考玛斯亮蓝染色方法判断融合蛋白的表达量及纯度。将纯化的ARMET免疫雌性BALB/c小鼠后采用淋巴细胞杂交瘤技术,获取分泌抗ARMET杂交瘤细胞株。体内诱生腹水法制备mAb,间接ELISA法测定其效价及抗体亚型,辛酸-硫酸铵沉淀法及亲和层析法纯化mAb。用免疫荧光双标及Western blot法对抗体的特异性进行了鉴定。结果获得了纯度较高、浓度较高的融合蛋白;建立了7株稳定分泌特异性抗ARMET mAb的杂交瘤细胞株,诱生腹水法获得的抗体效价在1×10-5～1×10-7之间,且均有较好的特异性。结论已成功制备出抗ARMET mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究奠定了基础。

柯萨奇B_3病毒单克隆抗体的制备及鉴定

用柯萨奇 B3病毒免疫 Balb/c小鼠。取脾细胞与 Sp2 /0细胞进行融合及细胞培养。用间接免疫荧光法筛选阳性细胞。并用 ELISA法等行 Ig类及亚类的鉴定。结果 :经融合、筛选、克隆化后共获得 2 6株稳定分泌特异性 Mc Ab的杂交瘤细胞 ,其中 3株分泌Mc Ab为 Ig G1类 ,2株为 Ig G2 b类 ,4株为 Ig G2 a类 ,1 7株为 Ig G3类。 2 6种 Mc Ab中除少数杂交瘤株的 Mc Ab能与同组不同型发生交叉反应及 Mc Ab2 B2 与 Polio 型、Mc Ab1 H10 与CVA4 有交叉反应外 ,其余的 Mc Ab仅与本型的病毒起反应。提示 CVB3- Mc Ab具有高度的特异性及均一性 。

抗人成骨肉瘤单克隆抗体的制备及其特性

目的 :制备抗人成骨肉瘤单克隆抗体并探讨其特性。方法 :用人骨肉瘤细胞系 OS- 732免疫 BAL B/ c小鼠 ,取其脾细胞与骨髓瘤细胞系 NS- 1融合 ,经酶联免疫吸附试验及补体依赖细胞毒实验筛选 ,获 3株分泌抗人成骨肉瘤单克隆抗体 (Mc Ab)的杂交瘤细胞。将手术切取经病理证实的骨肉瘤、软骨肉瘤、骨巨细胞瘤、滑膜肉瘤、平滑肌肉瘤、非骨化性纤维瘤、骨软骨瘤和正常肌、骨组织冰冻切片后 ,应用间接免疫荧光抗体实验检测。结果 :3株 Mc Ab均与骨肉瘤组织呈阳性反应 ,其中二株亦与软骨肉瘤呈阳性反应 ,与正常组织及其他肿瘤组织呈阴性反应。 3株 Mc Ab分别与骨肉瘤相关抗原不同的抗原决定簇结合。结论 :抗人成骨肉瘤单克隆抗体具有较高的特异性。

抗Ⅳ型胶原单克隆抗体的制备及其在IgA肾病中的应用

制备了抗Ⅳ型胶原单克隆抗体(McAb),利用 Western blot 法证实 McAb 与Ⅳ型胶原α_1链的120KD、95KD 和60KD 相结合,在 IgA 肾病中Ⅳ型胶原的分布与组织学改变成正相关关系,可以判断 IgA 肾病的病变程度和预后。