β-淀粉样肽与乙型肝炎核心抗原融合基因Aβ-HBcAg表达载体的构建

目的 构建 β 淀粉样肽 ( β amyloidpeptide ,Aβ)与乙肝核心抗原 (HBcAg)融合基因Aβ HBcAg的原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg ,为阿尔茨海默病基因工程疫苗的研究和制备奠定基础。 方法 采用非对称互补引物 /模板法 ,制备两端含有酶切位点的Aβ1- 42肽的cDNA ,将其连接到删除了Pre C区的HBcAg亚型ayw基因的N端组成融合基因Aβ HBcAg ,再将该融合基因亚克隆于载体 pBV2 2 0 ,构建为原核表达载体pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。 结果 经DNA测序 ,限制性内切酶酶切等方法证实已成功地将Aβ1- 42cDNA重组到HBVcore的N端 ,并将融合基因亚克隆于 pBV2 2 0内。 结论 成功构建了原核表达载体 pBV2 2 0 /Aβ HBcAg。

血清乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的研究

用 RIA 法检测了676份血清的 HBcAg,探讨了 HBcAg 与 HBV 五项血清学标志(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe 和抗-HBc),抗-HBcIgM及各型乙型肝炎的关系。结果表明:在 HBV 五项血清学标志的各种模式中,第1模式(HBsAg、HBeAg 和抗-HBc 阳性)和第2模式(HBsAg、抗-HBe和抗-HBc 阳性)的 HBcAg 检出率最高,分别为91.1％和86.5％,两者无显著差异(P>0.05),提示在 HBsAg、抗-HBc 阳性情况下,e 系统转化时,血清传染性无明显改变;HBcAg 与抗-HBcIgM 有密切的关系,提示后者也是反映 HBV复制的指标;HBcAg 在4例重症肝炎全部阳性,慢性活动性肝炎中94.7％阳性,看来 HBV 的持续存在与病变活动程度有关。

乙型肝炎病毒核心抗原HBcAg基因重组杆状病毒的构建及鉴定

目的利用杆状病毒表达系统(BEVS)构建含乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的重组杆状病毒。方法采用PCR法从含乙型肝炎病毒全基因序列(adw)的质粒pHBV1中扩增出HBVC基因,亚克隆到pGEM-T载体,然后将HBVC基因插入载体pAcGHLT-A中,构建含有HBVC基因的重组质粒pAcGHLT-HBcAg,与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)联合转染秋粘虫细胞(Sf9),获得含有HBVC基因的重组杆状病毒。采用限制性内切酶酶切和DNA序列分析对重组病毒进行鉴定。结果利用杆状病毒表达系统,成功地构建了含HBVC基因的重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9后,PCR检测可以扩增出相应大小的片段。结论利用BEVS成功构建了含有HBVC基因的重组杆状病毒,为进一步的研究奠定了基础。

乙型肝炎核心相关抗原的分子基础与临床应用

作为新近发现的血清学标志物,乙型肝炎核心相关抗原(Hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)由乙型肝炎核心抗原(Hepatitis core antigen,HBcAg)、乙型肝炎e抗原(Hepatitis e antigen,HBeAg)、p22cr组成。血清HBcrAg可反映肝内共价闭合环状DNA的水平及转录活性,并在一定程度上预测慢性乙型肝炎(简称乙肝)患者自然转归或核苷(酸)类似物、干扰素的疗效与预后,包括复发、功能性治愈等临床结局的发生率等,从而为临床抗病毒治疗起点与终点的确定、治疗方案的选择提供指导。同时,HBcrAg水平与乙肝相关的肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的发生率亦有关联,可识别潜在的HCC高危患者。因此,HBcrAg在慢性乙肝诊治中有着重要的临床应用价值。

乙型肝炎病毒前S2抗原决定簇（HBVPreS2epitope）与乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）的基因融合与表达

乙肝前Ｓ２（ＨＢＶＰｒｅＳ２）肽段由５５个氨基酸组成，其Ｎ端肽段含Ｔｈ和Ｂ细胞抗原决定簇。我们将化学合成的ＰｒｅＳ２ｅｐｉｔｏｐｅ（１２０－１４５）基因与ＨＢｃＡｇ基因不同位点进行融合，融合基因在大肠杆菌中获得表达，并对融合蛋白进行了纯化。经ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ实验表明，融合蛋白具有ＰｒｅＳ２和ＨＢｃＡｇ两者的抗原性。此外，研究还表明，强启动子能使表达水平有一定提高。

从肝癌组织中发现乙型肝炎病毒核心抗原编码基因突变

乙型肝炎病毒(HBV)引起的持续性感染是临床及流行病学的一大问题。导致HBV持续感染的因素之一可能是HBV出现变异株。我们曾以HBV表面抗原(S)基因、核心抗原(C)基因与乙型肝炎患者肝组织做核酸分子杂交,发现少数患者肝内C基因杂交信号减弱,1例有S基因整合但C基因缺失。为进一步研究C基因的变化,将33例原发性肝癌组织DNA,分别与C基因杂交。结果14/33的S抗原阳性,但其中仅3/14为C基因阳性,反映大多数肝癌患者C基因缺失。Southern吸印转移后杂交显示,3例肝癌组织中,2例同时存在复制型与整合型C基因(HBC1,HBC3),1例仅有复制型C基因(HBC2)。见图1。

乙型肝炎病毒核心抗原与金属硫蛋白相互作用的研究

探讨乙型肝炎病毒核心抗原 (HBcAg)在乙型肝炎发病机制中的作用 ,寻找防治乙型肝炎病毒 (HBV)感染的有效方法。应用改进的酵母双杂交技术构建HBcAg诱饵质粒 ,转化酵母细胞AH10 9后 ,与含肝文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交 ,经营养缺陷培养基(SD/ Trp Leu His Ade)及X gal双重筛选 ,获得真阳性菌落 16个 ,PCR扩增出靶基因 ,测序后进行生物信息学分析 ,发现其中含金属硫蛋白基因的菌落有 2个。进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实 ,金属硫蛋白与HBcAg间有确切的结合作用。

乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠的建立

目的 :建立乙型肝炎病毒核心抗原 (ayw亚型 )转基因小鼠模型。 方法 :采用受精卵显微注射的方法制备转基因小鼠 ,以 PCR、免疫组化和 H- E染色法分析导入基因在小鼠基因组中的整合、肝脏中的表达及肝组织的病理变化。结果 :得到 6只基因组中整合了核心抗原基因的首建者 (founder)小鼠 ,其中 1只在肝细胞核和胞浆均有 HBc Ag的表达。将肝脏中表达的小鼠继续传代 ,F1 代 10只小鼠中的 4只小鼠肝细胞有 HBc Ag的表达。 结论 :建立了乙型肝炎病毒核心抗原转基因小鼠 ,核心抗原基因能够在小鼠肝脏中表达 。

乙型肝炎病毒核心抗原DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性观察

目的 :观察乙型肝炎病毒核心抗原 ( HBc Ag) DNA疫苗对小鼠和猕猴的免疫原性。方法 :肌内注射法接种 HBc AgDNA疫苗 ;EL ISA法检测小鼠和猕猴血清抗 - HBc Ig G终点滴度和 Ig G亚类水平 ;51铬释放法测定小鼠脾细胞 HBc Ag特异性细胞毒性T细胞 ( CTL )活性 ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 ( PBMC)培养上清中 IFN -γ及 IL - 4水平 ;3H - Td R掺入法检测猕猴PBMC HBc Ag特异性增殖反应。结果 :小鼠和猕猴经接种该 DNA疫苗后均产生高滴度抗 - HBc抗体 (分别达 1∶ 3 2 80 5 0和1∶ 10 93 5 0 ) ;小鼠抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2 a为主 ,猕猴抗 - HBc Ig G亚类以 Ig G2占优势 ( Ig G1/Ig G2 <1) ;小鼠的 HBc Ag特异性CTL杀伤活性达 5 0 %以上 ;猕猴 PBMC培养上清中 ,IFN-γ水平与 IL - 4相比占明显优势 ( 15 .63 pg/ml vs <3 .13 pg/ml) ,猕猴PBMC抗原特异性增殖反应阳性 (刺激指数 =2 .12～ 3 .83 )。结论 :HBc Ag DNA疫苗对小鼠和猕猴均具有良好的体液免疫和细胞免疫原性。

传染性法氏囊病病毒抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分析

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因5epis的免疫效力,本研究应用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,构建基于HBcAg修饰基因(mHBc)的抗原表位嵌合体基因分子载体pET-mHBc。将编码IBDV多表位基因5epis定向插入到pET-mHBc的mHBc基因中,获得嵌合体基因mHBc-5epis表达重组质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。经SDS-PAGE分析,重组嵌合体蛋白的分子量约29 ku,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;Western blot结果表明,重组嵌合体蛋白可与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带;重组嵌合体蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约100 nm～120 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到1∶200。本实验成功构建了5epis与HBcAg嵌合体基因,并在大肠杆菌中高效表达,具有IBDV抗原反应性的重组病毒样颗粒嵌合体蛋白,为研究其表位型基因工程疫苗提供了新途径。

应用抗-HBc单克隆抗体研究乙型肝炎核心抗原的抗原位点

应用基因工程表达的乙型肝炎核心抗原(HBcAg)免疫Balb/c小鼠,取该鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,获得8株能稳定分泌高滴度抗HBcAg抗体的杂交瘤细胞株.用其中7株(4A4、4B5、3H6、3A5、1G8、1D3、5G10)与HBcAg亲和性相近的单克隆抗体(McAb)首次证明,在HBcAg上存在3个不同的抗原位点,并分别命名为α、β和γ. α抗原位点:能诱生中和及免疫沉淀抗体,在体外能中和HBcAg的抗原活性,能与HBc-Ag产生免疫沉淀线.如3H6、4A4、4B5、3A5等单克隆抗体. β抗原位点:不能诱生中和及免疫沉淀抗体,但此种单克隆抗体与4A4或4B5混合后即可与HBcAg产生免疫沉淀线.如1G8、1D3 McAbs. γ抗原位点:能诱生免疫沉淀抗体,但不能诱生中和抗体.如5G10McAb. 抗相同抗原位点的单克隆抗体之间可产生有意义的互相竞争抑制,而抗不同抗原位点的单克隆抗体之间则无,或很少有竞争抑制.对有关问题进行了讨论.

血清乙型肝炎核心相关抗原预测慢性乙型肝炎肝组织病理状态的评价

目的探讨和评价血清乙型肝炎核心相关抗原(HBcrAg)预测慢性乙型肝炎(CHB)肝组织炎症活动度和纤维化程度的效能。方法 CHB患者211例,其中HBeAg阳性和阴性患者分别为125例和86例。血清HBcrAg采用化学发光酶免疫法检测。数据处理和统计分析采用SPSS 16.0软件。结果 HBeAg阳性患者,血清HBcrAg与肝组织病理学分级和分期均呈显著负相关(r_s=-0.305,P=0.001和r_s=-0.370,P=0.000),在不同病理学分级和分期之间的差异均有统计学意义(r_s=16.756,P=0.000和r_s=25.003,P=0.000)。HBeAg阴性患者,血清HBcrAg与病理学分级和分期均呈显著正相关(r_s=0.476,P=0.000和r_s=0.556,P=0.000),在不同病理学分级和分期之间的差异均有统计学意义(r_s=22.529,P=0.000和r_s=26.416,P=0.000)。HBeAg阳性患者,血清HBcrAg预测病理学分级≥G3和分期≥S3的ROC曲线下面积分别为0.722和0.739(P=0.000和P=0.000);以血清HBcrAg≤4.81×104 kU/mL和≤8.13×104 kU/mL为标准,其预测病理学分级≥G3和分期≥S3的灵敏度、特异度、准确度分别为0.706、0.714、0.712和0.821、0.698、0.736。HBeAg阴性患者,血清HBcrAg预测病理学分级≥G2和分期≥S2的ROC曲线下面积分别为0.807和0.799(P=0.000和P=0.000);以血清HBcrAg≥40.18 kU/mL和≥10.64 kU/mL为标准,其预测病理学分级≥G2和分期≥S2的灵敏度、特异度、准确度分别为0.821、0.724、0.756和0.775、0.696、0.733。结论血清HBcrAg能有效地预测HBeAg阳性患者的肝组织严重炎症活动度和严重纤维化程度以及HBeAg阴性患者的肝组织显著炎症活动度和显著纤维化程度。

1653例血清乙型肝炎核心抗原的放射免疫分析

抗HBs固相吸附Dane氏颗粒,开壳剂释放HBcAg和竞争放射免疫测定HBcAg,检测1177例HBsAg阳性血清和476例常规法HBsAg阴性血清,结果HBcAg检出率前者70.4%后者1.7%。1177例HBsAg阳性血清,HBeAg阳性453例、抗HBe阳性497例、HBe系统阴性227例,HBcAg检出率分别为72.2%、70.6%和66.5%。此外还对100例HBsAg和HBcAg双阳性血清进行了HBv-DNA、前S_2蛋白、多聚蛋白受体的检测。

乙型肝炎病毒核心抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)和Flt3配体(FL)胞外段的双表达核酸疫苗。方法:将HBcAg和FL胞外段的基因用PCR方法扩增并分别引入相应的限制性内切酶酶切位点,然后克隆入真核双表达载体pIRES,获得含双基因片段的表达质粒;再取该表达质粒中的内部核糖体切入位点(IRES)序列和基因片段克隆入pJW4303载体中,获得相应的双表达核酸疫苗,经筛选鉴定后,以293T细胞瞬时表达检测两基因的表达水平。结果:构建成功以pIRES、pJW4303为载体的4种HBcAg和FL胞外段的双表达核酸疫苗,体外表达证实HBcAg和FL胞外段均能高效表达,基因位于IRES上游时表达水平较高。结论:用IRES元件实现了HBcAg和FL胞外段双表达核酸疫苗的构建,pJW4303为载体的核酸疫苗两基因表达水平优于pIRES为载体的核酸疫苗。

乙型肝炎病毒前S1抗原(1-42)与核心抗原(1-144)在大肠杆菌中表达的融合蛋白CS1的免疫原性研究

对重组乙型肝炎 (乙肝 )病毒前S1抗原 (1- 42 )及核心抗原 (1- 144 )表达的融合蛋白CS1进行了免疫原性的研究分析 ,以便为探索HBV治疗性疫苗的研制提供实验依据。用脂质体转染的方法转染小鼠肥大细胞瘤细胞系P815 ,用乳酸脱氢酶的方法检测了该融合蛋白诱导小鼠的细胞毒T淋巴细胞 (CTL)反应 ,用ELISA方法测定了小鼠的体液免疫反应。结果表明 ,用脂质体转染的方法建立了表达乙肝核心和前S1抗原的细胞系 (P99- 815 ) ,该融合蛋白诱导出小鼠的细胞毒T淋巴细胞 (CTL)反应 ,小鼠的体液免疫反应也较好。这为今后进一步探索慢性乙肝治疗性疫苗奠定了必要的基础。

乙型肝炎核心抗原的简易提取及其在免疫粘连血凝法检测核心抗体中的应用

自Almeida等[1]于1971年发现乙型肝炎核心抗原(HBcAg)及其抗体(抗HBc)系统以来,研究证明抗HBc的出现是乙肝病毒(HBV)感染的重要标志[2]。测定抗HBc能检出HBsAg、抗HBs系统所不能发现的HBV感染[3].

乙型肝炎病毒e抗原与核心抗原调节靶基因的比较

目的利用基因表达谱芯片技术筛选、比较乙型肝炎病毒e抗原和核心抗原调节靶基因。方法利用分子生物学技术和生物信息学技术相结合,克隆HBeAg和HBcAg的编码基因,常规分子生物学技术构建相应的真核细胞表达载体pcDNA3.1-HBeAg和pcDNA3.1-HBcAg脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,利用基因表达谱芯片技术筛选转染细胞的差异表达cDNA的类型。结果对于2个基因转染细胞系差异表达基因谱的分析,HBeAg和HBcAg共同上调的基因1条;HBeAg和HBcAg共同下调的基因1条;未发现HBeAg上调,而HBcAg下调;或HBeAg下调,而HBcAg上调的基因类型;还有一些靶基因,或只受到HBeAg的调节,或只受到HBcAg的调节。结论应用基因表达谱芯片技术对于HBeAg和HBcAg反式调节的靶基因进行分析,可以发现HBeAg和HBcAg可引起体内多个系统相关的基因表达改变,两者在体内所调节的基因种类方面还有很大差异。

猕猴对乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗的特异性细胞免疫应答

目的 观察乙型肝炎病毒核心抗原核酸疫苗即 HBc Ag核酸疫苗 (p JW430 3/ HBc)免疫猕猴的特异性细胞免疫应答。方法 猕猴分别在第 0、2、4、6个月肌肉注射法接种核酸疫苗 (p JW430 3/ HBc)或对照质粒 (p JW430 3) ;EL ISA法检测猕猴外周血单个核细胞 (PBMC) ,经特异性抗原 (HBc Ag)刺激后 ,培养上清中人白细胞介素 - 4(IL- 4)和干扰素 γ(IFN- γ)以及猕猴血清中抗 - HBc Ig G亚类水平 ;3H- TDR掺入法测定猕猴 PBMC特异性增殖反应。结果 接种核酸疫苗后猕猴 PBMC培养上清中以IFN- γ升高为主。血清中特异性抗体 (抗 - ΗΒc) Ig G亚类以 Ig G2占优势。免疫组猕猴 PBMC抗原特异性增殖反应明显增强 ,增殖指数达 3.83,与对照猕猴相比有显著差异。结论 p JW430 3/

乙型肝炎患者HBeAg、前-S1抗原、核心抗体-IgM与ALT升高的比较

目的研究乙型肝炎患者在表面抗原(HBsAg)阳性情况下,检测乙肝e抗原(HBeAg)、前S1抗原(PreS1Ag)、核心抗体IgM(抗HBcIgM)与谷丙转氨酶(ALT)升高的关系及对肝功能的影响。方法对185例乙肝HBsAg阳性患者的HBeAg、PreS1Ag、抗HBcIgM及ALT进行检测,并对其阳性率及相互关系进行分析比较。结果HBeAg阳性时,ALT升高占45%;PreS1Ag阳性时,ALT升高占29%;抗HBcIgM阳性时,ALT升高占96%。结论对于乙肝感染者,只检测“两对半”是不够的,补充PreS1Ag、抗HBcIgM检测十分必要,它们对乙肝病毒感染者的早期诊断、病毒分别、疗效观察、预后估计以及对肝功能的损伤程度等可起到重要的提示作用。

乙型肝炎核心抗原与e系统间的关系

应用放射免疫分析检测494例e系统阳性慢性乙肝病人血清中乙肝核心抗原(HBcAg)。结果显示HBeAg阳性病人HBcAg检出率为86.1%,抗-HBe阳性病人HBcAg检出率为47.1%,两者有显著性差异(P<0.01);若结合其它血清学标志,在不同血清学标志组合模式下比较:模式Ⅰ(HBsAg、抗-HBc和HBeAg同时阳性)的HBcAg检出率为85.6%,模式Ⅱ(HBsAg、抗-HBc和抗-HBe同时阳性)的HBeAg检出率为90.1%,两者无显著性差异(P>0.05)。提示既往认为HBeAg转变为抗-HBe作为病毒复制停止、病情缓解的指标是不确切的。从血清学角度判断病毒复制及传染性时应从整体出发,不单以某一系统为依据。