携带BCoV抗原表位的乙型肝炎病毒核心抗原病毒样颗粒的制备及免疫效果评价

为了制备可用于牛冠状病毒(BCoV)亚单位疫苗的含BCoV S蛋白抗原表位的病毒样颗粒(VLP),本研究将BCoV S1和S2蛋白中含B细胞表位的aa351~aa403(159 bp)和aa771~aa784(42 bp)对应的密码子按大肠杆菌偏好性原则优化后插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)主要免疫显性区域(MIR),合成该重组基因后克隆至pET-32a(+),经酶切鉴定显示正确构建了重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-BCoV S1+S2。将该重组质粒分别转化E.coli BL21(DE3)和伴侣感受态细胞BL21(DE3)(含pG-KJE8分子伴侣质粒),经诱导表达后采用镍柱亲和层析法纯化两种不同表达形式的重组蛋白,SDS-PAGE检测重组蛋白的表达及纯化效果,结果显示两种表达系统均正确表达了重组蛋白,分别命名为VLP-A、VLP-B,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达。纯化后浓度分别为0.9 mg/mL、1.4 mg/mL。利用透射电镜观察纯化后的两种重组蛋白是否形成VLP,结果显示二者均形成VLP,且可溶性表达的重组蛋白形成的VLP产量略高。将两种VLP乳化后以50μg/只分别免疫小鼠,于免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d采血制备血清,采用ELISA方法检测小鼠血清中的BCoV IgG特异性抗体水平及细胞因子IFN-γ、IL-4,结果显示,将两种VLP乳化后免疫小鼠产生的BCoV IgG抗体(P<0.01)和两种细胞因子水平(P<0.05)均显著高于对照组,且可溶性表达的VLP诱导产生的抗体水平和细胞因子水平更高。本研究首次制备了含BCoV S蛋白抗原表位的VLP,两种不同表达形式的重组蛋白均形成VLP,且在小鼠体内均能够产生免疫应答,为BCoV亚单位疫苗及相关生物制品的制备奠定了基础。

基于乙型肝炎病毒核心蛋白的颗粒性肽展示载体的构建

为提高HBVpreS1aa21 47的免疫原性,将1～6拷贝的preS1(21 47)片段以串联方式插入HBcAg的aa78和aa82之间,在大肠杆菌中进行表达和纯化.携带1～3拷贝的重组抗原CI、CII和CIII的表达产量约占菌体总蛋白的20%,而携带4～6拷贝的重组抗原则未见明显表达.电镜检测显示重组抗原CI、CII和CIII可以形成形态与HBcAg类似的类病毒颗粒,颗粒直径在30～34nm之间.ELISA分析显示这3种VLP抗原具有很强的preS1抗原的免疫反应性,而对HBc单克隆抗体则基本失去反应性.提示外源多肽pre(21 47)可被有效地递呈至类HBc颗粒的表面,且外源多肽的插入使HBc主要的免疫优势表位遭到了破坏.这些证据表明利用HBcAg的专一性呈递能力来构建多价抗原可作为免疫原设计时的一种策略.

乙型肝炎病毒S基因不同区域嵌合丙型肝炎病毒中和抗原表位病毒样颗粒实验研究

目的:串联丙型肝炎病毒(HCV)中和抗原表位嵌合在乙型肝炎病毒(HBV)S基因不同区域并对形成的病毒样颗粒(VLP)进行比较。方法:选取3种HCV中和抗原表位进行串联,分别嵌合在HBV S基因亲水区和氨基端胞外区,构建两种表达载体pCI-NE m S和pCI-S1E_(m) S2。通过10次重复实验转染人胚胎肾细胞293T(HEK293T细胞)后收集培养上清,经过浓缩、纯化制备VLP-NE_(m) S和VLP-S1E_(m) S2。采用电化学发光法对两种VLP进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)定量检测,分析两种VLP含量均值的差异。结果:VLP-S1E_(m) S2的HBsAg均值低于VLP-HBS(P<0.05),而VLP-NE_(m) S与VLP-HBS比较差异无统计学意义(P=0.157)。结论:胞外区嵌合VLP-NE_(m) S与亲水区VLP-S1E_(m) S2浓度结果有区别,胞外区含量较高。

乙型肝炎病毒核心颗粒的结构和包装

本文从结构和功能的关系出发阐述乙型肝炎病毒核心颗粒的结构组成及其在装配中的作用

在昆虫细胞中同时表达蓝舌病毒VP3与VP7蛋白可装配成核心样颗粒

将蓝舌病毒 (BTV) 13型 S7与L3基因同时插入杆状病毒双表达载体 pFastBacDual,获得重组杆状病毒rvBacBTVP37。该病毒在昆虫细胞中同时高水平表达BTV13VP3与VP7蛋白 ,可以高效自动装配出 2 0面体的 6 0～ 70nm空心颗粒。分析表明 ,所获颗粒为空心的BTV核心样颗粒 (CLP) ,其成分为VP3与VP7,不含BTV其它任何蛋白与核酸。这种装配需要VP3与VP7的共同参与 ,二者缺一不可 ,它们均含有相互作用与装配的信息。本研究为BTV病毒样颗粒的装配打下了基础 ,并为BTV结构与功能研究提供了良好模型。

蓝舌病16型病毒核心样颗粒的获取与鉴定

为了制备一种新型基因工程疫苗BTV-16 VLP疫苗,将蓝舌病病毒16型VP3与VP7基因片段插入杆状病毒双表达载体pFastBac Dual质粒中,通过转染Sf9细胞,同时表达VP3与VP7蛋白。经负染后电镜观察到有与蓝舌病病毒形态相似的核心样颗粒,表明蓝舌病VP3与VP7蛋白能自主组装形成核心样颗粒,并通过Western Blot试验验证该核心样颗粒与蓝舌病病毒具有相同的抗原性。因此本研究成功构建出16型蓝舌病病毒核心样颗粒,为病毒样颗粒装配打下了基础,为制备16血清型BTV VLP疫苗做好前期准备。

流行性非甲非乙型肝炎的研究进展——应用免疫电镜法从病人粪便中发现病毒样颗粒

直到不久以前,人们还认为印度的水源性肝炎流行是由经粪口途径传播的甲型肝炎病毒引起。但近期研究表明这些肝炎既不是由甲肝病毒(HAV),也不是由乙肝病毒(HBV)引起,而可能是一种新类型的肝炎,即流行性非甲非乙型肝炎。这种肝炎的确定主要基于排除甲肝和乙肝的感染以及它的独特临床、流行病学特征。

乙型肝炎病毒核心颗粒重组疟疾表位疫苗的免疫原性研究

全世界有2～4亿的疟疾感染者,且每年有100万～200万人死于恶性疟疾。既往研制的疟疾疫苗有用放射线照射的疟原虫孢子体、合成肽疫苗和重组乙型肝炎病毒(HBV)颗粒疟疾疫苗。以放射线照射的孢子体免疫可诱导保护性体液和细胞免疫,缺点是孢子体不能在体外进行培养。合成肽疫苗包含环孢蛋白(CS)

以乙型肝炎病毒核心区为载体的“a”决定簇基因免疫效果评价

目的评价以乙型肝炎病毒核心区为载体的HBsAg“a”决定簇编码基因的基因免疫效果。方法分别使用将编码截短型乙肝病毒核心抗原的主要免疫显性区替换为表面抗原“a”决定簇嵌合基因的真核表达质粒；编码表面抗原“a”决定簇部分的质粒和空载体为免疫原，免疫4～6周龄的BALB／c小鼠，定期采血检测体液免疫应答情况并取免疫后小鼠脾细胞进行淋巴细胞增殖试验。结果嵌合质粒免疫组针对HBsAg的体液应答水平低于非嵌合质粒免疫组，且未引起较强的HBcAb体液免疫应答，但获得了较强的HBcAg和HBsAg特异性的细胞应答。结论该嵌合质粒作为基因疫苗可以引起较强的HBcAg和HBsAg特异性的细胞应答并诱导小鼠产生HBsAb。HBcAg在一定程度上可以增强对插入抗原的免疫应答，是一种有效的病毒样颗粒载体；该嵌合基因有望成为一种新的慢性HBV感染的治疗性基因疫苗。

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因融合表达蛋白对肝癌细胞胰岛素样生长因子1受体表达的影响

目的建立HBVX-HCVC融合蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-1的影响。方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBVX基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCVC的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCVC和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBVX和HCVC蛋白表达。流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-1受体蛋白表达。结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCVC和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达。表达融合蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-1受体活性较转染空载体的细胞及单独表达HBVX、HCVC蛋白的细胞明显升高。结论HBVX-HCVC融合蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-1受体活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用。

乙型肝炎病毒X基因-丙型肝炎病毒C基因共表达对肝癌细胞胰岛素样生长因子-2表达的影响

目的建立HBV X-HCV C共表达蛋白细胞表达模型,并探讨其对细胞胰岛素样生长因子-2(IGF-2)的影响。方法双酶切质粒pXT1-X,得到完整的HBV X基因片段后,将其插入到质粒PBK-CMV和PBK-HCV C的相应酶切位点,得到重组质粒PBK-X和PBK-X-C;再将质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C分别导入肝癌细胞株HepG2中,G418筛选,RT-PCR、蛋白印迹鉴定HBV X和HCV C蛋白表达。流式细胞仪、蛋白印迹检测IGF-2蛋白表达。结果质粒PBK-CMV、PBK-X、PBK-HCV C和PBK-X-C在HepG2细胞中有稳定表达。表达共表达蛋白的细胞的胰岛素样生长因子-2活性较转染空载体的细胞及单独表达HBV X-HCV C蛋白的细胞明显升高。结论HBV X-HCV C共表达蛋白能显著上调胰岛素样生长因子-2活性,提示HBV、HCV可能具有协同致癌作用。

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原(HBcAg)为载体呈现猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域(MIR),构建重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a(+)-HBcAg-PEDV S1,并在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。

HBV病毒样核心颗粒应用研究进展

病毒样颗粒(virus like particles,VLPs)是一种模拟病毒的颗粒形态特点,将外源基因片断产物呈递到病毒颗粒表面而形成的嵌合颗粒。它有与病毒颗粒相同的外部形态,甚至还有某些病毒受体的天然配体,同时还可将其他病原的特异性抗原等呈递在自己的表面,因而在病原体的疫苗研究和基因治疗研究中发挥着重要的作用。目前研究得较多的病毒样颗粒有HIV gag颗粒、HBc颗粒、HBs颗粒、酵母Ty颗粒等等,其中HBc VLP较受人注目。 HBc有自动组装的特性,其形成的核心颗粒有显著刺激B细胞、T辅助细胞及细胞毒T细胞产生免疫反应的能力,而且HBc颗粒在人体内没有细胞毒性作用,再加上HBc容许插入外源片段并可保持或增强外源蛋白的免疫活性,基因表达的杂合蛋白在多种表达体系中都具备颗粒形成能力,且形成的颗粒易于纯化制备。以HBc为载体的疫苗生产研究、基因治疗方法研究在国外日益受到重视。现将有关这方面的研究进展简述如下。

乙肝病毒核心蛋白病毒样颗粒作为载体在表位疫苗中的应用

乙型肝炎病毒核心抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)C基因编码的病毒蛋白,是HBV的衣壳蛋白,主要存在于HBV核衣壳表面。乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)来源于HBcAg,由183或185个氨基酸组成。由于HBc本身具有高度的免疫原性,并且可携带自身或外源病原体的抗原/表位在体外自组装成病毒样颗粒,20世纪80年代开始HBc就被用于疫苗载体的研究。现对HBc近年来作为载体在表位疫苗中的应用作一概述。

晚期血吸虫病患者检测血清乙型肝炎病毒核心抗体的临床意义

近年来，很多学者强调检测乙型肝炎病毒核心抗体（抗-HBc）对肝炎的诊断与鉴别诊断具有实用价值。本文报道用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测晚期血吸虫病（晚血）患者血清抗-HBc。

重组乙型肝炎病毒病毒样颗粒在小鼠体内的免疫原性

目的 评价重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)在小鼠体内的免疫原性。方法 分别用不同剂量的NLMS疫苗(含有NL、M和S蛋白的HBV VLPs疫苗,蛋白终浓度0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5μg/mL)及上市疫苗(蛋白终浓度4、2、1、0.5、0.25μg/mL)经腹腔免疫雌性BALB/c小鼠,0.5 mL/只,每组20只。免疫4周后,经小鼠眼内眦静脉采血,分离血清,采用HBsAb检测试剂盒检测HBsAb阳转情况,计算半数有效剂量(ED50)。用NLMS疫苗(蛋白终浓度1μg/mL)及上市疫苗(蛋白终浓度20μg/mL)分别于0及2周经小鼠腹腔免疫,0.5μg/只。于初次免疫后2、3、4、5、6、7周,经小鼠内眦静脉采血,分离血清,采用相应试剂盒检测小鼠血清中S抗体水平;初次免疫后7周,相应试剂盒检测小鼠血清中preS1、preS2抗体水平及IFNγ、IL-2、IL-6含量。结果 免疫4周后,NLMS疫苗及上市疫苗的ED50分别为0.039及1.095μg/mL,95%置信区间分别为0.032~0.049和0.881~1.406μg/mL,两组疫苗ED50差异有统计学意义(χ^(2)=34.0,P <0.05)。两剂次免疫后,两组小鼠血清抗体效价均于初次免疫后7周达最高,NLMS疫苗组S抗体效价为1∶4 096,preS1抗体效价为1∶64,preS2抗体效价为1∶128;上市疫苗组S抗体效价为1∶1 024,preS1及preS2抗体均在检测限以下。两组间3种抗体效价差异均有统计学意义(t分别为-2.025、17.433、-7.844,P均<0.05)。两种疫苗均能刺激小鼠脾淋巴细胞产生不同水平的IFNγ、IL-2和IL-6,且显著高于阴性对照组(F分别为250.1、425.6、652.8,P均<0.05)。结论 NLMS疫苗可诱导小鼠机体产生更强烈的体液免疫应答,同时产生S、preS1和preS2抗体,并可诱导相应的细胞免疫应答。

HBcAg病毒样颗粒与疫苗设计

寻找有效的疫苗来治疗肿瘤和微生物感染性疾病一直是人们追求的目标。近年来,基于乙型肝炎病毒核心抗原的颗粒疫苗在该领域取得了一些新的进展。本文就这些新的进展作一综述。

正负电荷改性乙肝病毒样颗粒的构建及性能评价

乙肝病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein,HBc)可在体外自组装成二十面体的病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),但是其较低的自组装效率及稳定性制约其应用.通过蛋白质改造修饰,在野生型HBc(wtHBc)的免疫显性区(major immunodominant region,MIR)分别插入带电多肽序列RRRRRRRR和DDDDDDDD,以通过荷电基团及静电相互作用的引入提高VLPs稳定性.经大肠杆菌重组表达,成功获得携带额外电荷的HBc突变体(mHBc),包括携带额外正电荷的m+HBc和负电荷的m-HBc.结果表明,mHBc的二级结构富含α-螺旋,与wtHBc一致.m+HBc和m-HBc等比例混合可在体外实现自组装,所得mHBc VLPs粒径为(30.44±2.23)nm,与野生型一致.该自组装过程及组装体稳定性受离子强度和pH值影响.使用尺寸排阻色谱、原子力显微镜、动态光散射等方法表征和分析VLPs在不同缓冲液中的稳定性差异.发现wtHBc VLPs可稳定存在于0.3~0.7 mol/L NaCl溶液中,盐浓度过高或过低均会使其稳定性降低.pH响应性实验表明,wtHBc VLPs的最佳组装及稳定pH值为7.4,偏离此pH值使其稳定性降低.在低于pH=5.5的环境下,其相对稳定性明显降低,只达到pH=7.4的64.2%.而mHBc VLPs的稳定性差异随pH值变化不大,在pH测试范围5.5~9.5的相对稳定性均高于88.3%.以上研究结果表明,正、负电荷基团的引入可提高HBc VLPs对pH值变化的耐受性,拓宽稳定pH值区间,增强VLPs的稳定性,利于其实际应用.

HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达及病毒样颗粒的形成

目的 在昆虫细胞中同时表达HCV的核心蛋白C和包膜蛋白 (E1、E2 )以形成病毒样颗粒 (VLP)。方法 利用PCR技术得到HCV的核心蛋白和包膜蛋白基因 ,用基因重组技术分别构建表达HCVC、E1和E2蛋白的重组杆状病毒 ,用SDS PAGE电泳分析HCV结构蛋白在昆虫细胞中的表达。电镜观察昆虫细胞内VLP的形成。结果 得到了能表达HCVC蛋白和同时表达E1、E2蛋白的重组杆状病毒reBV/C和reBV/E1、E2。reBV/C和reBV/E1、E2共感染的昆虫细胞同时表达了C、E1和E2蛋白 ,分子量分别为 2 0kD ,35kD和 6 6kD。电镜观察到表达HCV结构蛋白的昆虫细胞质中存在大量的直径为 4 0～ 6 0nm的VLP ,对照细胞无此结构。结论 在昆虫细胞中表达的HCVC。