乙型肝炎病毒基因B型及基因C型两种国家标准品研制

目的研制乙型肝炎病毒(HBV)基因B型及基因C型两种国家标准品。方法收集我国不同地区的HBV感染者血浆样品,经HBV五项、DNA病毒检测,从中筛选出11份基因分型标准品候选品样品。经HBV序列测定,进化树分析,初步确定2份样品分别为HBV B型及C型标准品候选品。分别将2份候选品离心、分装后,进行HBV基因分型验证测定,并进行定量的协作标定测定。结果确认筛选出HBV基因B型及基因C型标准品,其HBV DNA浓度分别为4.67×10~7IU/mL(CV为3.6%)及3.66×10^(8)IU/mL(CV为2.9%)。装量检查,大于0.5 mL/支,符合规定。均匀性检查,两者P值分别为0.428(F值为1.140)及0.420(F值为1.173),分装的标准品支与支之间浓度均匀无差异。将两种标准品在不同方式保存(反复冻融、4℃保存、室温及37℃放置)后,测定结果与-80℃保存样品测定结果相比较,绝对偏差均在±0.2的范围内,方差分析P值均大于0.1;另外,-20℃保存12个月后与-80℃保存样品两者测定数据分析,B型P值为0.237(F值为1.934)、C型P值为0.173(F值为2.737),P值均大于0.1,稳定性验证符合规定。结论制备了HBV基因B型及基因C型两种国家标准品,为我国HBV基因分型试剂的质量控制和标准化提供了依据。

基于十八年跨度的乙型肝炎病毒基因型I分子进化研究

目的 探索乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)基因型I长期进化特征。方法 从广西隆安研究队列中选取已明确感染基因型I的HBsAg无症状携带者作为研究对象,检测其血清HBV标志物和病毒载量。使用酚氯仿法提取HBV DNA,采用巢式PCR扩增HBV全基因组,进行克隆测序,运用BioEdit、Mega等软件对测序结果进行生物信息学分析。结果 共纳入9名研究对象,获得279条全长基因序列。系统进化树分析结果显示,22.2%(2/9)的研究对象HBV基因型发生了转换,从基因型I1转换成基因型C1。2004年所有研究对象HBV毒株均发生X基因核心基因启动子(BCP)双突变(nt1762A→T/1764 G→A);88.9%(8/9)的研究对象HBV毒株发生PreC基因nt1896(G→A)终止密码突变。多数研究对象发生免疫逃避突变和耐药突变,共检出18种免疫逃逸突变和6种多重耐药突变。研究对象GD056、XW511、GA135、XX55、CZ647、TX119、WX058和YF201携带的毒株免疫逃逸突变率分别为:69.6%、7.5%、96.7%、94.4%、11.8%、4.7%、100.0%和100.0%;研究对象GA135、XW511、WX058、XX55、YF201、CZ647和TX119携带的毒株耐药突变率分别为:6.7%、2.5%、3.8%、50.0%、4.5%、2.9%和4.7%。66.7%、55.6%和44.4%的研究对象2004年和/或2022年携带的HBV毒株分别在PreS/S基因、X基因和PreC/C基因受到正向选择压力,所有研究对象携带的HBV毒株在P基因以负向选择压力占主导。结论 在自然感染进程中,HBV基因型I可以发生基因型转换,基因型I在一些常见的临床相关热点突变上突变率较高,部分毒株可出现免疫逃避突变和耐药突变,HBV基因组各个开放读码框所受的选择压力不相同。

兰州地区乙型及丙型病毒性肝炎基因型分布研究

目的探讨兰州地区乙型肝炎病毒(HBV)与丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布特点。方法采用PCR-荧光探针法对2018年1月至2023年8月在该院就诊的1130例HBV感染者、1781例HCV感染者进行基因型检测。采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析。结果HBV感染者基因型分布以C型最多,为925例(82.0%),其次为B型124例(11.0%);B、C、D基因型间患者性别分布比较,差异无统计学意义(χ^(2)=3.66,P=0.09),而在各年龄段患者中比较,差异有统计学意义(χ^(2)=33.88,P=0.01)。HCV感染者基因型分布主要为2a型930例(52.2%),其次为1b型737例(41.4%);各基因型间患者性别分布比较,差异有统计学意义(χ^(2)=46.31,P=0.01);各年龄段患者1b、2a基因型分布比较,差异有统计学意义(χ^(2)=18.36,P=0.01)。结论在兰州地区病毒性肝炎患者中,HBV C型与HCV 2a型为主要感染基因型;HBV B、C、D型分布与年龄有关;HCV各基因型分布与性别有关,HCV 1b、2a型分布因年龄不同而有差异。

甘肃地区乙型肝炎病毒分型和耐药突变分析

目的 探讨甘肃地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布特征及耐药情况,为乙型肝炎患者抗病毒用药提供指导依据。方法 选择2018年1月至2019年8月于该院就诊的131例乙型肝炎患者,通过Sanger测序法分析患者HBV基因型和耐药突变位点分布情况。结果 131例乙型肝炎患者共检出B、C、D 3种基因型。其中B型2例(1.53%),C型126例(96.18%),D型3例(2.29%)。检出51例核苷酸类似物耐药,总耐药率为38.93%,其中B型1例,C型49例,D型1例。耐药突变位点最多见于M204V/I,多位点突变以M204V/I+M204V联合突变多见,常在此基础上发生3位点、4位点甚至5位点突变。与阿德福韦酯相关的A181V/T、N236T、A181V/T+N236T耐单药突变最常见,共15例(29.41%)。耐多药突变36例(70.59%),主要以拉米夫定和替比夫定联合耐药为主,在此基础上多有恩替卡韦联合耐药发生。结论 甘肃地区HBV患者基因型以C型为主,耐药形势严峻,突变组合模式复杂多样,应及时检测患者HBV基因型及耐药突变位点,以评价乙型肝炎患者临床疗效,并指导临床抗病毒治疗合理用药。

HBx蛋白抑制乙型肝炎病毒诱导肝细胞表达Ⅰ型干扰素的研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)对Ⅰ型干扰素表达的影响,并进一步探讨相关机制。方法:以HepG2细胞和稳转HBV基因组的HepG2.2.15细胞为模型,转染针对乙型肝炎病毒X(HBx)基因的小干扰RNA(siRNA)[HBx-siRNA]至HepG2.2.15细胞,转染HBx蛋白表达质粒pEGFP-HBx至HepG2细胞,荧光定量PCR技术分析各细胞中的IFN-α、IFN-β mRNA含量,荧光显微镜观察HepG2细胞内质粒pEGFP-HBx的表达,Western blot技术分析各细胞中HBx和p-IRF3蛋白含量变化,以探讨HBV通过HBx蛋白对Ⅰ型干扰素表达的影响。结果:IFN-α和IFN-β mRNA在HepG2.2.15细胞中的含量略高于HepG2细胞,差异无统计学意义(P>0.05);RNA干扰抑制HepG2.2.15细胞中HBx蛋白的表达后,细胞中IFN-α、IFN-β mRNA含量显著升高,转染pEGFP-HBx的HepG2细胞中Ⅰ型干扰素的基因表达量和p-IRF3的蛋白表达量均降低。结论:HBV通过HBx蛋白抑制IRF3蛋白的活化,从而抑制Ⅰ型干扰素的表达。

IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌组织中的表达及临床意义

目的探究IKBKE在乙型肝炎病毒相关肝癌(HBV-HCC)组织中的表达及其与临床特征和预后的相关性。方法通过组织芯片免疫组织化学染色方法来检测HBV-HCC患者的癌组织和癌旁组织中B细胞编码κ轻链多肽基因抑制激酶E(IKBKE)的蛋白表达;整理并分析患者的一般资料、临床体征及病理报告结果,检测相关的血液指标;使用Pearson相关性分析比较IKBKE在肝细胞肝癌组织中的表达及其与患者的一般临床资料、临床体征、血液指标、病理结果和预后的相关性。结果该研究发现,在HBV相关的肝癌患者中,IKBKE的蛋白表达在癌组织中的表达水平显著高于正常组织,高表达组的生存时间明显低于低表达组。此外,IKBKE表达与肝硬化程度呈负相关,与TFF3、pCEA和Ki67等指标呈正相关。结论IKBKE、TFF3、pCEA和Ki67的联合检测有助于预测HBV相关肝癌的预后。

HBV pgRNA联合cccDNA对慢性乙型肝炎患者抗病毒疗效的预测价值

目的探究乙型肝炎(HBV)前基因组RNA(pgRNA)联合共价闭合环状DNA(cccDNA)对慢性乙型肝炎(CHB)患者抗病毒疗效的预测价值。方法收集2019年8月至2022年8月期间于本院进行抗病毒治疗的96例CHB患者的临床资料,根据患者治疗48周后是否获得完全应答分为完全应答组(78例)及非完全应答组(15例)。检测患者不同时间HBV cccDNA和HBV pgRNA水平,Logistic回归分析影响CHB患者获得完全应答的因素,并应用受试者工作特征(ROC)曲线分析pgRNA与cccDNA联合检测在抗病毒疗效的预测价值。结果96例患者中78例抗病毒治疗后获得非完全应答;完全应答组治疗24、48周HBV pgRNA、HBV cccDNA水平均低于非完全应答组(P<0.05);Logistic回归分析显示,治疗24周HBV pgRNA、HBV cccDNA高水平及治疗前ALT低水平是影响CHB患者抗病毒治疗无效的独立危险因素(P<0.05);经ROC分析显示,HBV pgRNA预测CHB患者抗病毒疗效的AUC值为0.618,95%CI为0.513~0.716,HBV cccDNA预测的AUC值为0.667,95%CI为0.561~0.760,二者联合预测的AUC值为0.881,95%CI为0.799~0.938。结论HBV pgRNA与cccDNA在CHB患者抗病毒治疗中下调,且治疗24周HBV pgRNA联合cccDNA检测对CHB抗病毒疗效具有更高的预测价值。

2018年盐城市CVA6型肠道病毒全基因组分子特征分析

目的掌握盐城市肠道病毒CVA6型基因进化特征。方法对盐城市鉴定为CVA6型的肠道病毒,通过反转录聚合酶链式反应的方法扩增全基因组序列,扩增产物经纯化测序,采用相应的生物信息软件进行核苷酸及氨基酸序列比对、分子进化树构建以及重组分析。结果盐城市2018年共检测疑似疱疹性咽峡炎病例107例,肠道病毒核酸阳性率73.83%,其中CVA6、CVA16、其他肠道病毒分别占50.63%、5.06%、44.30%,未检出EV71。选取3株2018年疱疹性咽峡炎、3株2018年手足口病(流行月峰前、峰中、峰后)、1株2017年手足口病CVA6型代表株进行全基因组测序,遗传进化树显示:7株盐城株位于B进化分支B2基因亚群分支,3株疱疹性咽峡炎CVA6型代表株与2株2018年手足口病CVA6型毒株聚集成簇构成一进化小分支,2株手足口病毒株(2017年、2018年各1株)形成独立的进化小分支,形成2条传播链。选取2个进化小分支中疱疹性咽峡炎、手足口病CVA6型各1株,进行分子进化重组分析,均未发现明显的重组来源。结论2018年盐城市疱疹性咽峡炎的病原谱呈现遗传多样性,CVA6型肠道病毒为优势流行株,与手足口病的CVA6型肠道病毒可能有着共同的来源,盐城株未发现基因重组。

2022至2023年度黄埔区腹泻儿童诺如病毒感染及基因型的研究

目的:对2022年至2023年广州市黄埔区儿童感染诺如病毒(NoV)开展病原学调查,阐明该人群中NoV的基因型分布。方法:采集急性腹泻儿童1~3 d内的粪便标本,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测NoV核酸,选择45份阳性样本扩增病毒部分RdRp区基因、VP1区基因、功能未知碱性蛋白酶(ORF3编码)基因,并进行基因测序分析。结果:45份阳性样本中,35份感染的NoV属于GⅡ.P31(GⅡ.Pe)/GⅡ.4毒株,10份属于GⅠ.P6/GⅠ.6毒株。对于GⅠ.P6/GⅠ.6毒株,很难通过未知功能碱性蛋白酶基因序列进行进一步分类,而GⅡ.P31(GⅡ.Pe)/GⅡ.4毒株则可能通过未知功能碱性蛋白酶基因序列进行进一步分类。结论:2022年至2023年广州市黄埔区2~6岁儿童NoV感染主要以GⅡ组为主,其次是GⅠ组;对于GⅡ.P31(GⅡ.Pe)/GⅡ.4毒株有希望通过未知功能碱性蛋白酶基因序列进行进一步分类。

pre-S基因变异与乙型肝炎病毒感染患者肝功能和肝纤维化的相关性

目的 研究了pre-S基因变异与乙型肝炎病毒(HBV)感染患者肝功能和肝纤维化的相关性。方法 选取2019年12月至2022年6月该院收治的HBV感染者178例为研究对象,其中无症状HBV携带患者65例作为对照组,慢性乙型肝炎(CHB)患者70例作为CHB组,乙型肝炎肝硬化患者43例作为肝硬化组。比较对照组、CHB组、肝硬化组患者的pre-S基因变异情况、肝功能和肝纤维化指标水平。根据是否发生基因缺失变异,将HBV感染患者分为变异组和非变异组,比较变异组和非变异组的肝功能和肝纤维化指标水平。采用Spearman相关分析pre-S基因变异类型与患者肝功能和肝纤维化指标的相关性。结果 对照组和CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,CHB组pre-S基因缺失变异率明显低于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。对照组和CHB组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于肝硬化组,清蛋白水平明显高于肝硬化组,差异均有统计学意义(P<0.05)。非变异组ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸以及Ⅲ型前胶原肽水平明显低于变异组,清蛋白水平明显高于变异组,差异均有统计学意义(P<0.05)。pre-S基因缺失变异与ALT、AST、层粘连蛋白、透明质酸、Ⅲ型前胶原肽水平均呈正相关(P<0.05),与清蛋白水平呈负相关(P<0.05)。结论 pre-S基因缺失变异与HBV感染患者肝功能和肝纤维化指标明显相关。

隐匿性乙型肝炎病毒感染者病毒基因跨膜结构变异性分析

目的分析隐匿性乙型肝炎病毒(HBV)感染(OBI)者血清样本中HBV S区基因跨膜结构(TM)突变导致的氨基酸替换现象,探讨造成HBV表面抗原(HBsAg)漏检的原因和临床意义。方法选取上海中医药大学附属第七人民医院检验科采集的28例OBI患者血清样本(OBI组)和10例慢性HBV感染(CHB)患者血清样本(CHB组)。采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增OBI组和CHB组HBV S区基因,扩增产物分别进行克隆测序和直接测序,进而进行核苷酸序列比对分析。结果OBI组TM1~TM4共26个位点发生185次突变,突变率为3.1%(185/6052),TM1、TM2、TM3、TM4突变率分别为1.6%(16/1020)、2.2%(28/1292)、4.2%(97/2312)、3.1%(44/1428)。CHB组TM发生4次突变,突变率为0.4%(4/890),TM1、TM2、TM3均未发生突变,TM4突变率为1.9%(4/210)。OBI组TM突变率、TM4突变率均高于CHB组,差异均有统计学意义(χ^(2)=19.92,P<0.01;χ^(2)=0.89,P=0.03)。OBI组TM1、TM2、TM3、TM4亲水性突变率分别为62.5%(10/16)、71.4%(20/28)、38.1%(37/97)、20.5%(9/44),4者比较差异有统计学意义(P<0.01)。OBI组共发现7种精氨酸替换突变,分别为C85R、L162R、W163R、W172R、L186R、W191R、C211R。结论HBV S区基因TM突变导致疏水性氨基酸替换为亲水性氨基酸,会导致临床上HBsAg的漏检,产生OBI现象。

慢性乙型肝炎患者乙肝病毒基因分型和病毒载量的相关性及临床意义

目的探讨乙肝病毒基因分型和乙肝病毒载量及临床表现的关系。方法选取中国人民解放军总医院第五医学中心2019年1月至2021年12月收治的乙型肝炎患者600例,统计分析患者采用荧光PCR的方法进行乙肝病毒基因分型和HBV DNA载量。结果根据病毒基因分型结果显示,B型123例(20.5%),C型447例(74.5%),B/C混合型2例(0.3%),非B非C型28例(4.7%)。HBV DNA载量结果显示,C型HBV DNA水平较B型显著增高,C型患者肝硬化、原发性肝癌与B型患者比较,差异有统计学意义(χ^(2)=10.75,P<0.05);C型HBV DNA水平明显高于B型,差异有统计学意义(P<0.05)。结论感染HBV基因型以C型为主,C型HBV DNA水平显著高于B型,C型较B型对肝脏损伤大。

慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒基因型与血清病毒学指标相关性分析

目的探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者乙型肝炎病毒(HBV)基因型和血清病毒学指标特征,并分析其相关性。方法选取2019年1月至2023年1月于厦门大学附属第一医院杏林分院收治的185例CHB患者作为研究对象。分别用微流基因芯片法、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和化学发光微粒子免疫分析法检测各患者HBV基因型、HBV DNA载量和乙型肝炎e抗原(HBeAg)。结果185例CHB患者中HBV B型、HBV C型和其他类型分别为92例、73例和20例;无症状携带者(ASC)、慢性轻中度乙型肝炎(CMHB)、慢性重度乙型肝炎(CSHB)和肝硬化(LC)4组HBV基因型分布比较,差异有统计学意义(P<0.05)。185例CHB患者中HBeAg阳性和HBV DNA阳性分别为54例和68例;ASC组、CMHB组、CSHB组和LC组4组血清HBeAg和HBV DNA阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。CHB患者HBV基因型不同,其HBeAg和HBV DNA阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同HBV基因型在性别、年龄、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)和腺苷脱氨酶(ADA)比较上差异无统计学意义(P>0.05),但在丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)和甲胎蛋白(AFP)比较上差异有统计学意义(P<0.05)。经Logistic逐步回归分析得知,HBeAg、HBV DNA和AFP水平与HBV基因型状态相关(P<0.05)。结论该地区CHB患者HBV基因型以B和C型为主,与HBeAg和HBV DNA相关,其中HBV C型CHB患者肝损严重,更易进展为肝硬化和肝癌,须引起临床重视。

乙醛脱氢酶2基因多态性与慢性乙型肝炎病毒的相关性分析

目的:分析慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染人群乙醛脱氢酶2(ALDH2)基因多态性特点。方法:选取2018年6月—2022年1月庆阳市人民医院传染科肝病门诊就诊的有饮酒习惯且乙肝表面抗原(HBsAg)阳性患者96例为研究对象,其中乙肝e抗原阳性31例。收集患者基本资料及生化指标,通过检测ALDH2基因多态性,分析不同基因分型相关指标及HBV-DNA病毒载量。结果:ALDH2基因多态性有3种,即ALDH2 Glu504Glu(GG)型、ALDH2 Glu504Lys(GL)型、ALDH2 Lys504Lys(LL)型。GG组天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、γ-谷氨酰转移酶、碱性磷酸酶水平高于GL、LL组,差异有统计学意义(P<0.05)。野生型慢性乙型肝炎(CHB)患者HBV-DNA水平高于突变型,差异有统计学意义(P=0.021)。结论:饮酒状况、基因分布与HBV感染者的疾病发展有相关性,提示有饮酒嗜好的CHB患者应及时检测ALDH2基因多态性,从而更好地的指导诊断、早期干预,改善预后。

乙型肝炎病毒前基因组RNA评估恩替卡韦治疗乙型肝炎E抗原阳性慢性乙型肝炎疗效的价值

目的探讨恩替卡韦(ETV)对乙型肝炎E抗原(HBeAg)阳性慢性乙型肝炎(CHB)患者疗效,并观察血清乙型肝炎病毒(HBV)前基因组RNA(pgRNA)水平、评估其疗效价值。方法选取2019年1月至2021年6月东莞广济医院收治的确诊为HBeAg阳性的78例CHB患者为研究对象进行回顾性分析。根据患者ETV治疗12个月后HBeAg是否获得完全应答分为获得组(35例)和未获得组(43例)。两组患者均采用ETV治疗12个月,观察患者治疗过程中血清HBV pgRNA水平及谷丙转氨酶(ALT)各时间点动态变化,并探讨ETV治疗后患者获得应答情况与HBV pgRNA水平及ALT水平的相关性。结果两组患者治疗3、6、12个月的血清HBV pgRNA水平显著低于入组时,且获得组低于未获得组(P<0.05);血清HBV pgRNA水平与获得完全应答呈负相关(P<0.05)。两组患者治疗3、6、12个月的ALT水平显著低于入组时,且获得组低于未获得组(P<0.05);ALT水平与获得完全应答呈负相关(P<0.05)。结论血清HBV pgRNA、ALT水平与HBeAg阳性CHB患者ETV的疗效具有相关性,可用于评估疗效。

一株基因Ⅲ型禽呼肠孤病毒变异株的分离及其灭活疫苗免疫原性初步评价

为了解禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)变异株在我国的流行情况及其生物学特性和致病特点,试验采集黑龙江省某企业送检的病鸡关节组织进行病毒分离,通过RT-PCR、序列分析及常见禽类外源病毒检测鉴定,进一步通过对体外复制能力、致病性、血清交叉中和能力及灭活疫苗免疫抗体水平检测,分析其致病性、抗原性和免疫原性。结果显示:成功从病鸡关节组织中分离到1株ARV,命名为ARV-HLJ21-1690401,该分离株位于基因Ⅲ型分支,与基因Ⅲ型参考株ISR5233和42563-4-2005遗传距离较近,氨基酸序列相似性为83.4%和81.7%,而与其他基因型分离株遗传距离较远;该分离株在LMH细胞上增殖良好,对鸡胚和SPF鸡均具有明显的致病性,可引起接种鸡胚90%死亡,接种6周龄SPF鸡可引起100%发病;该分离株具有良好的免疫原性,其制备的灭活疫苗免疫SPF鸡可诱导产生较好的抗体水平。综上所述,研究成功分离到一株具有致病性和良好免疫原性的基因Ⅲ型ARV变异株,为了解我国ARV变异株的流行及遗传进化特征提供了重要理论依据。

不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是危害养牛业的重要病原。2021年本实验室从患有肺炎的牛肺中分离出1株BVDV(毒株编号为JS2201),经鉴定为1b亚型。为了评价该分离株的毒力与致病性,分别建立了分离株与参考株BVDV-1型Oregon C24V株、BVDV-2型C1602株BVDV感染BALB/c小鼠模型,通过检测攻毒后小鼠临床症状、体重变化、病毒血症情况、血液中白细胞与淋巴细胞的变化、组织器官的病理组织学变化及病毒载量,比较了分离株JS2201与1型和2型参考株的致病性差异。结果显示:BVDV分离株JS2201与参考株均能够成功感染BALB/c小鼠,攻毒BALB/c小鼠均形成病毒血症,导致血液中白细胞数量、淋巴细胞数量以及淋巴细胞百分比短暂下降;BVDV分离株JS2201株攻毒组小鼠肝脏、肾脏、肺脏、脾脏中BVDV载量要高于C24V、C1602株攻毒组;攻毒组小鼠均表现为间质性肺炎病变,JS2201株攻毒组与1型参考株C24V株攻毒组小鼠肺脏病理组织学变化相似,BVDV-2型参考株C1602株攻毒组小鼠肺脏病变更为严重。综上,本研究成功建立了不同亚型BVDV急性感染BALB/c小鼠的模型,且比较分析了分离株与参考株之间的致病性差异,为BVDV疫苗的研制以及致病机制的研究奠定了基础。

基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定

为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。

鸡呼肠孤病毒基因I型变异株的分离鉴定和致病性分析

为探究导致山东省某肉种鸡场种鸡出现腿病的病原并进行致病性分析,本试验从该肉种鸡场收集病料,进行鸡胚分离、细胞传代、反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测、序列分析、商品肉鸡的致病性试验和免疫攻毒保护试验。结果显示,分离获得1株鸡呼肠孤病毒(ARV),命名为ARV-LL-2020,该病毒对鸡胚的致死率为100%,在鸡肝癌细胞系(LMH)上具有较强的适应性。ARV-LL-2020毒株与经典的S1133疫苗株同属基因Ⅰ型,但两者的主要抗原σC基因的核苷酸同源性为73.6%,氨基酸同源性为59.1%。ARV-LL-2020毒株回归商品肉鸡能复制出与实际生产中完全一致的发病症状。S1133株商品化弱毒活疫苗对ARV-LL-2020毒株的保护率仅有50%。结果表明,导致种鸡腿病的ARV-LL-2020毒株是1株ARV基因I型变异株,目前S1133株商品化弱毒活疫苗无法对其提供完全保护。

柑桔衰退病毒RB和VT基因型实时定量PCR检测方法建立和应用

为定量检测样品中柑桔衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)RB和VT基因型含量,以RB基因型的p33基因、VT基因型的ORF1a基因为靶标,建立了RB和VT基因型的特异性实时定量PCR方法。该方法检测RB和VT基因型质粒浓度下限均为2×10^(1) copies/μL,灵敏度为普通PCR的1000倍;对RB和VT基因型进行检测,质粒拷贝数对数(x)与Ct值(y)的标准曲线方程分别为y=-3.3255 x+37.8453和y=-3.2737 x+36.2839,R^(2)分别为0.9991和0.9954,扩增效率分别为99.85%和102.05%;方法的重复性良好,组内和组间Ct值变异系数均小于2.07%。对田间样品检测发现,不同样品之间RB基因型含量差异和VT基因型含量差异均较大。该方法特异性强,灵敏度高,适用于田间样品检测。