乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展

乙型肝炎是感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起肝脏慢性炎症性改变为主要特征的一类传染病。长期慢性感染将导致肝纤维化、肝硬化、肝癌等终末期肝病的发生,严重危害人民群众的健康。慢性乙型肝炎病毒感染依然是全球公共卫生健康问题之一。目前临床上使用的抗病毒治疗方案难以实现对乙型肝炎病毒的彻底清除,其根源在于被感染肝细胞核内持续存在具有稳定结构的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)。本文对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA清除的研究进展进行综述,旨在寻找清除cccDNA的途径及办法从而达到乙型肝炎病毒的彻底清除。

慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量检测的临床意义

目的探讨慢性乙型肝炎患者血清乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)的临床意义。方法选取经肝组织病理学诊断的慢性乙型肝炎患者57例,其中乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性37例,HBeAg阴性20例;肝组织炎症轻度33例,肝组织炎症中度24例。采用实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)同时定量检测其血清HBVDNA和cccDNA。结果HBeAg阳性组血清HBV cccDNA对数值和阳性率分别高于阴性组,8.1±1.3vs6.5±1.9,73.0%vs30.0%(均P<0.01)。肝组织炎症轻度组(G1～G2)血清HBVcccDNA对数值低于中度组(G3),7.1±0.4vs8.5±0.4(P<0.01)。血清cccDNA与丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶呈正相关(r=0.612、0.632,均P<0.05)。结论血清HBVcccDNA为病毒复制的标志物,与肝组织细胞损伤相关。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA在慢性乙型肝炎治疗中的分子生物学研究进展

在乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染过程中,共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒复制产生的所有RNA和新病毒颗粒合成的模板,而当前的治疗方法很难彻底清除cccDNA.在cccDNA的产生过程中,由病毒前基因组RNA反转录合成松弛环状(relaxed circular,r c)DNA的细节目前已经比较明确,而对rcDNA转变为cccDNA的过程人们还知之甚少.最近的研究把cccDNA的形成和细胞DNA修复联系起来,并表明此过程是病毒与细胞相互作用的关键环节.本文将综述cccDNA的分子生物学研究进展,分析当前研究中遇到的障碍,并讨论把cccDNA作为治疗慢性乙型肝炎的靶点的前景.

靶向核定位序列siRNA对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA复制的抑制作用

目的针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区设计并化学合成2条小干扰RNA(siRNA),观察其对共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)水平的影响。方法将siRNA转染可稳定分泌HBV颗粒的HepG2.2.15细胞,转染后72 h,采用ELISA方法检测上清液中HBsAg、HBeAg的含量,采用Real-time PCR定量检测细胞内cccDNA及细胞培养上清HBV DNA拷贝数。RT-PCR检测靶基因mRNA的抑制效果。结果靶向NLS区的2条siRNA均能不同程度地降低HepG2.2.15细胞cccDNA水平,抑制HBV DNA的复制及HBeAg的分泌,对cccDNA的抑制率分别为93.30%和85.00%(P<0.01),对HBV mRNA抑制率分别为62.80%和48.90%,对HBV DNA抑制率分别为76.56%和66.41%(P<0.01),对HBeAg抑制率分别为57.25%、43.48%(P<0.01)。而无关序列对HBV DNA与cccDNA的复制和HBeAg表达几乎无干扰作用。结论靶向HBV核心蛋白C末端核定位序列的siRNA可特异、高效、稳定地显著降低HBV cccDNA水平,抑制HBV DNA复制及HBeAg分泌,为应用RNA干扰治疗HBV感染奠定了一定基础。

利用乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA构建慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型

目的通过水动力法注射乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)构建C57BL/6小鼠慢性乙型肝炎病毒感染的模型。方法取29只C57BL/6小鼠,分为实验组、对照组和空白组,应用水动力法分别注射HBV cccDNA、pAAV-HBV1.2及等渗盐水,于注射后收集不同时间点的血清和肝组织。利用放射免疫法检测血清样本中乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg);荧光定量PCR检测血清和肝组织中HBV DNA拷贝数;免疫组织化学法检测肝组织中HBsAg和乙型肝炎病毒核心抗原(HBc Ag)的表达;苏木精-伊红(HE)染色观察肝组织病理变化;使用SPSS 17.0对数据进行统计学分析。结果实验组HBsAg和HBeAg表达均呈现4个上升-下降曲线:HBsAg峰值分别出现在第3天、第3周、第7周和第9周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第1周、第4周和第10周。对照组HBsAg和HBeAg表达分别呈现2个或3个明显的峰:HBsAg峰值分别出现在第3天和第8周;HBeAg峰值分别出现在第1天、第3周和第10周。空白组未检测出HBsAg和HBeAg。实验组HBV DNA拷贝数高于对照组的拷贝数(P<0.01);肝组织中HBV DNA拷贝数高于同期血清中的拷贝数(P<0.01);实验组和对照组的肝组织中均有HBsAg和HBc Ag的表达;实验组与对照组出现肝脏细胞炎症、肝细胞纤维化、肝细胞坏死等病理变化,而空白组正常。结论利用水动力法向C57BL/6小鼠体内转入HBV cccDNA,成功建立了慢性乙型肝炎病毒感染的小鼠模型,与对照组比较,新建立的小鼠乙肝模型具有更高的HBV表达,动物模型为研究乙型肝炎病毒HBV cccDNA的感染及其引起肝损伤的机制奠定了基础。

慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的定量检测

目的探讨肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（HBV CccDNA）水平与病毒复制、肝组织损伤的关系。方法应用荧光定量聚合酶链反应（PCR）方法检测46例慢性乙型肝炎患者肝组织HBV CccDNA水平,同时检测肝组织和血清中HBV DNA、肝细胞乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和乙型肝炎核心抗原（HBcAg）表达及肝功能。结果将肝组织中HBV CccDNA定量水平分为低（〈104copies/mg）、中（104-106copies/mg）、高（〉106copies/mg）3组,3组中HBsAg阳性表达差异无统计学意义,但105~106copies/mg和〉107copies/mg组HBcAg阳性表达高于〈104copies/mg组,分别为105-106copies/mg组HBcAg表达14例（63.6%）和〉107copies/mg组7例（77.8%）vs〈104copies/mg组2例（13.3%）（P〈0.01）;HBeAg阳性组肝组织中HBV CccDNA和肝组织总HBV DNA均显著高于HBeAg阴性组,分别为肝组织中HBV CccDNAHBeAg阳性组（8.72±1.94）log10copies/mg vs HBeAg阴性组（6.54±1.56）log10copies/mg;肝组织中HBV DNAHBeAg阳性组（7.45±1.82）log10copies/mg vs HBeAg阴性组（5.27±1.48）log10copies/mg（均P〈0.01）;肝组织中HBV CccDNA与肝组织总HBV DNA、血清HBV DNA呈正相关（均P〈0.05）;而与肝组织炎症程度、肝纤维化程度、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）无相关性。结论肝组织中HBV CccDNA定量能准确反映病毒复制水平,但不能将其视为肝组织损伤的标志。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA检测方法及临床应用研究进展

近年来,随着乙型肝炎的研究不断深入,乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）共价闭合环状DNA（covalently c1osed circular DNA,cccDNA）引起了广泛的关注.它被认为是HBV在细胞内开始复制并建立感染的重要标志和抗病毒后乙型肝炎复发的主要原因[1],这些特性使得cccDNA成为了乙型肝炎研究中的一个关键点,清除cccDNA已成为目前抗HBV药物研究的一个重要目标[2-3].

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA研究进展

共价闭合环状DNA(cccDNA)是乙型肝炎病毒的原始复制模板,对乙型肝炎病毒的复制具有重要的意义,药物难以清除。近年来,国内外对cccDNA的研究取得了新的进展,学者们对不同标本中cccDNA的检测,及临床上对cccDNA的清除等进行了广泛的研究。现就有关乙型肝炎病毒cccDNA方面的研究进展予以综述。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究进展

共价闭合环状DNA(Covalently Closed CircularDNA,cccDNA)是HBV DNA在宿主细胞核内的存在形式,是HBV复制和转录的模板,长期存在于细胞核中,是HBV持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素,对HBV的复制及感染状态的建立具有重要意义。本文旨在对cccDNA的合成调节、清除、检测意义等方面的研究进展作一综述。

应用微环DNA技术体外诱导和制备重组的乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)是病毒慢性感染的分子基础。本课题组前期研究通过Cre/loxP介导的位点特异性DNA重组策略,在细胞核内由前体质粒诱导重组cccDNA(rcccDNA^(loxP))产生,首次建立了HBV cccDNA的体外培养细胞和小鼠实验模型。本研究基于大肠埃希菌ZYCY10P3S2TPhiC31重组酶诱导表达系统,建立了一种体外诱导HBV rcccDNA(rcccDNAattR)微环产生和纯化的策略。纯化的rcccDNA^(attR)微环具有超螺旋结构,细胞培养实验证实其能支持功能性的HBV复制和抗原表达。与普通的线性HBV复制子编码质粒相比,rcccDNA^(attR)尾静脉高压注射小鼠模型能诱导显著延长的病毒抗原血症。因此,本研究在原核表达系统和实验小鼠水平提供了一种更为简化的HBV cccDNA实验模型系统,并再次显示rcccDNA具有显著的稳定性,能作为一种基本策略在小鼠模型中诱导病毒持续感染。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究现状

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）在病毒持续感染、停药后复发及药物抵抗等方面起关键的作用。本文对cccDNA形成机制、代谢调控、研究模型、检测方法和临床应用进行了简要综述。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的研究现状及进展

目前,乙型病毒性肝炎(乙肝)是一种不能被治愈的疾病。乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)是HBV前基因组复制的原始模板,是导致HBV持续感染的关键因素。本文参考近几年的临床与动物实验结果,就HBV cccDNA的研究现状及进展做一综述。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA

HBV共价闭合环状脱氧核糖核酸（cccDNA）是嗜肝 DNA病毒基因组的复制中间体，是嗜肝 DNA 病毒部分基因的mRNA和前基因组 RNA的合成模板，在 HBV感染初期即能检测到，且长期存在于细胞核中。其在 HBV 复制过程中起着关键的作用，它的长期存在也是乙型病毒性肝炎慢性化的主要原因之一。HBV cccDNA肝细胞中持续感染及抗病毒治疗复发之间的关系受到广泛的关注与肯定，现就 HBV cccDNA 常用检测方法及其临床意义作一综述。

两种抽提乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的效果比较

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)作为一种嗜肝DNA病毒,在感染肝细胞后会在细胞核中形成病毒转录复制的模板和基因储存库——共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA),其持续存在是乙型肝炎慢性化和难以治愈的核心,也是此研究领域内的重点。从细胞样品中稳定抽提获取cccDNA对于保证cccDNA检测的准确性至关重要。Hirt法是一种抽提真核细胞染色体外DNA的方法,被用于HBV cccDNA的抽提,但存在操作复杂和耗时长等问题。为简化操作,有研究对Hirt法进行改良,结合硅胶膜离心柱来抽提染色体外DNA,但尚不清楚该法用于HBV cccDNA抽提与传统Hirt法的效果差异。本研究基于HBV cccDNA细胞转染系统、HBV复制细胞系及感染系统,以DNA印迹(Southern blot)和定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)作为检测评价手段,平行比较了传统Hirt-酚/氯仿法与改良Hirt-过柱法抽提HBV cccDNA的效果。结果表明,两种方法具有相当的抽提效率和抽提特异性,而改良Hirt-过柱法耗时更短,提示在进行细胞HBV cccDNA抽提时可选择改良Hirt-过柱法以提高实验效率。

原位聚合酶链反应检测肝细胞内乙型肝炎病毒共价闭合环状的DNA表达

目的探讨乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA(HBV-cccDNA)在慢性乙肝患者肝细胞中的表达及意义。方法选取活动性乙型肝炎及乙型肝炎后肝硬化患者肝穿或重症乙肝患者尸检肝组织标本50例,经10%甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,用0.05%多聚赖氨酸处理后使用。分别设立无引物、无地高辛标记引物、无TaqDNA聚合酶PCR反应体系及非乙肝患者肝组织共10例作为阴性对照。采用原位PCR技术进行HBV-cccDNA检测。结果HBV-cccDNA在乙肝患者肝细胞中阳性表达以核型为主,呈蓝紫色,在肝细胞中总阳性表达率为60%～85%;偶见于细胞浆中,对照组均为阴性。结论原位PCR可以在肝细胞原位检测出HBV-cccDNA,阳性信号以核型为主,提示HBV-cccDNA主要存在于细胞核中,为乙肝病毒持续感染及复制的根源。

54例慢性乙型肝炎患者肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA与血清HBsAg定量检测结果分析

目的检测慢性乙型肝炎患者肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）和血清HBsAg，分析两种定量指标之间及其与血清HBVDNA载量的相关性。方法应用PSAD消化＋滚环扩增＋跨缺口实时荧光PCR方法，定量检测54例慢性乙型肝炎患者甲醛固定石蜡包埋肝组织HBVcccDNA水平；用化学发光试剂定量检测患者血清HBsAg。用Pearson检验及直线回归分析方法对数据进行分析。结果患者肝组织HBVcccDNA与血清HBsAg定量水平之间呈正相关（r=0．459，P〈0．01），但与血清HBVDNA载量相关性无统计学意义；血清HBsAg定量水平与血清HBVDNA载量呈正相关（r=0．328，P〈0．05），与病毒复制效率呈负相关（r=－0．373，P〈0．05）。结论慢性乙型肝炎患者肝组织HBVcccDNA载量与血清HBsAg定量水平相关，结合血清HBVDNA定量检测，可以更全面的反映HBV的复制水平，评价抗病毒疗效。

抗病毒药物对肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的影响

目的 探讨抗病毒药物对肝组织HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）的影响。方法71例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者分别接受48周的拉米夫定-干扰素序贯治疗、单用拉米夫定治疗和24周的干扰素治疗，随访24周。检测治疗前、后肝组织HBVDNA和cccDNA水平；检测治疗前、后及停药24周时的血清HBVDNA和ALT水平。比较C、B基因型HBV感染患者肝组织HBVDNA和cccDNA水平。结果治疗结束时，序贯治疗、拉米夫定治疗和干扰素治疗组患者肝组织HBVDNA分别为（4．7±1．1）log10、（4．6±1．5）log10和（5．6±1．5）log10，均低于治疗前水平（P〈0．05）；cccDNA分别为（3．4±1．3）log10、（3．8±1．1）log10和（5．0±1．5）log10，均低于治疗前水平（P〈0．05）。17例患者出现了HBeAg血清学转换，其肝组织cccDNA下降幅度明显大于HBeAg阳性患者（3．0log10比1．6log10，P〈0．05）。停药24周，18例患者获得持续病毒学应答，其cccDNA基线值明显低于停药后出现病毒反跳患者（P〈0．05）。肝组织cccDNA的变化与肝组织HBVDNA的改变正相关（P〈0．05）；治疗结束时，肝组织cccDNA水平与血清HBeAg滴度正相关（P〈0．01）。C基因型与B基因型HBV感染患者治疗前、后肝组织HBVDNA和cccDNA的变化无统计学意义（P〉0．05）。结论48周的拉米夫定-干扰素序贯治疗和拉米夫定治疗对肝组织cccDNA抑制作用强于24周的干扰素治疗。肝组织cccDNA低水平患者易获得较好的抗病毒疗效。HBV基因型对肝组织cccDNA含量无明显影响。

乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA荧光定量聚合酶链反应法的建立及应用

乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV基因组复制中间体mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染的关键。近期研究表明，cccDNA也是抗病毒治疗结束后乙型肝炎复发的主要原因。本研究旨在建立和应用荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）检测慢性乙型肝炎患者血清HBV cccDNA水平。

对乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA的再认识

乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA）是乙肝病毒前基因组RNA（pgRNA）的转录模板，对HBV的循环复制以及感染状态的建立均有十分重要的意义。从cccDNA的角度重新认识HBV感染和清除过程，有助于澄清现有的一些模糊概念，更深刻地理解HBV的致病机制，更理性地确定抗病毒治疗的策略和目标，

肝组织乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA定量与拉米夫定、阿德福韦疗程的关系

细胞外HBVDNA是一种松弛环状的双链DNA（rcDNA）分子，其丽条链均不闭合。HBV共价闭合环状DNA（HBVcccDNA）是一种不断折叠而形成的超螺旋结构DNA分子，是嗜肝病毒持续感染的关键因素。在乙型肝炎（乙肝）抗病毒治疗过程中，单纯依靠监测外周血HBVDNA远不够。本研究对治疗前、治疗过程中乙肝患者进行肝组织活检，定量分析肝组织中HBVcccDNA，同时检测肝组织及血清HBVDNA，探讨其相互关系，为临床选择抗病毒治疗方案、确定治疗终点等提供理论依据。