乙型肝炎病毒抗原表位模拟多肽诱导CTL应答的研究(英文)

目的 应用分子设计技术设计治疗性多肽 ,以探讨基于乙型肝炎病毒 (HepatitisBvirus,HBV)核心抗原优势细胞毒性T淋巴细胞 (CytotoxicTlymphocyts,CTL)表位的多肽设计与启动HLA Ⅰ限制性HBV特异性CD8+ T细胞应答的关系。方法 合成含HBcAg免疫优势CTL表位、Pre S2蛋白优势B细胞表位和破伤风类毒素通用TH 表位的多肽 ,并进行HLA A2 + 人PBMC体外和Balb/c小鼠体内免疫学功能研究。结果 上述多肽可在体内外诱导CD8+ CTL应答。以棕榈酸为分子内佐剂的Palm p4 4可诱导较强的CD8+ CTL应答 ,与单纯多肽比较不需另加佐剂。结论 脂类分子内佐剂可显著提高多肽的免疫原性 ;Palm p4 4可作为乙型肝炎治疗性多肽疫苗设计较有效的候选分子。

HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建

目的:构建乙型肝炎病毒表面抗原细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体(HBsAg-SCT)真核表达载体,在真核细胞293T中表达,并构建含HBsAg-SCT的腺病毒载体。方法:合成H-2Ld限制的HBsAg细胞毒性T细胞表位寡核苷酸,与H-2Ld分子融合,构建含HBsAg-SCT的真核表达载体,并转染293T细胞,采用流式细胞技术观察HB-sAg-SCT在细胞表面的表达。将HBsAg-SCT亚克隆到腺病毒载体,转染293A细胞,包装产生携带HBsAg-SCT的重组腺病毒。结果:成功构建了HBsAg-SCT真核表达载体,并在真核细胞中表达。利用重组腺病毒载体制备出高滴度的重组腺病毒。结论:含HBsAg-SCT的真核表达载体能够在真核细胞表面有效表达,获得含HBsAg-SCT的重组腺病毒,为研究HBsAg-SCT免疫治疗HBV感染打下基础。

乙型肝炎病毒核心颗粒重组疟疾表位疫苗的免疫原性研究

全世界有2～4亿的疟疾感染者,且每年有100万～200万人死于恶性疟疾。既往研制的疟疾疫苗有用放射线照射的疟原虫孢子体、合成肽疫苗和重组乙型肝炎病毒(HBV)颗粒疟疾疫苗。以放射线照射的孢子体免疫可诱导保护性体液和细胞免疫,缺点是孢子体不能在体外进行培养。合成肽疫苗包含环孢蛋白(CS)

辅助性T细胞表位HBV表面抗原融合基因真核表达质粒的构建

为提高HBVDNA疫苗的免疫效率,将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5’末端,构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因,产物与pMD18T载体连接,经HindⅢ,EcoRI双酶切,再克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。酶切及测序鉴定,该真核表达载体构建成功,为进一步观察其特异性细胞和体液免疫反应奠定了基础。

稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株的筛选与鉴定

目的建立稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组NS-1细胞株。方法将以HBV多表位复合基因取代脊区基因的杂合HBc真核表达质粒转染NS-1细胞,经G418及亚克隆筛选高表达阳性细胞株,并以RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测、鉴定重组细胞表达产物。结果筛选所得稳定表达细胞株经RT-PCR、ELISA、间接免疫荧光及Western blotting等方法检测均呈阳性反应,而阴性对照及空白对照未出现相应阳性反应。结论筛选获得稳定表达含HBV多表位短肽的杂合HBc颗粒的重组细胞株,命名为NS/HBc-Mep。为建立HBc-Mep特异的cELISA及CTL活性测定等实验方法提供可靠的靶细胞。

转基因表达HBV抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞受体

目的通过逆转录病毒介导HBV抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)的T细胞受体(TCR)转基因表达,初步观察其结合活性。方法从HLA-A2阳性急性乙肝患者外周血中诱导、分选、克隆和扩增HBV抗原特异性CTL;提取细胞RNA,用RT-PCR、5'-RACE和OVER-LAP PCR等方法获取TCR的α和β链编码基因;构建TCR重组逆转录病毒,介导特异性TCR分别在人Jurkat T细胞和HLA-A2阳性健康人CD8 T淋巴细胞上表达。结果从1例HLA-A2阳性急性乙肝患者样本中分别获得了2组TCR Vα、Vβ配对,分别命名为α21β13、α15β13,包装的重组逆转录病毒滴度为(1.5～5.0)×105IU/mL,用针对目标TCR的特异性Vβ链抗体(抗Vβ13 TCR-PE)和HLA-A2限制性表位特异性五聚体(pentamer)进行免疫荧光染色,重组TCR在T细胞表面获得表达:其中在Jurkat细胞上转入的Vβ13链表达细胞占1.06%～2.25%,在HLA-A2阳性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞分别占到1.03%～2.06%和1.05%～1.12%,在HLA-A2阴性健康人T细胞上Vβ13阳性细胞和pentamer阳性细胞均低于0.05%。结论通过逆转录病毒介导可以使HBV特异性CTL TCR获得转基因表达,具有结合HLA-A2限制性表位的活性。

中国乙型肝炎病毒流行株的适应性进化分析

目的:检测中国乙型肝炎病毒(HBV)B型和C型4个基因(区)(S、C、X和RT)的正选择位点,推断近年来中国HBV的变异趋势和原因。方法:从基因库下载中国所有B型和C型全长序列共864条,参照标准序列分别截取S、C、X和RT 4个基因(区),使用HyPhy方法筛选各基因序列集的正选择位点并进行统计和分析。结果:共检测到226个正选择位点(B型101个,C型125个),其中85个位点(B型37个,C型48个)分别位于75个(B型32个,C型43个)抗原表位上,表明正选择的发生与病毒的免疫逃逸相关。值得注意的是,B型RT区的3个耐药位点180、181和223,和C型RT区的4个耐药位点173、180、181和223,也被检测到受到正选择压力,表明正选择发生与耐药发生相关。结论:中国地区HBV B型和C型的RT区受到的选择压力与耐药突变存在潜在联系,其他区域的正选择与病毒的逃逸机制密切相关。

人类白细胞抗原限制性乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞表位研究进展

不同个体在乙型肝炎病毒(HBV)感染后的免疫学和临床转归不同,这与宿主的人类白细胞抗原(human leukocyte antigens,HLA)等免疫遗传学背景和HBV自身特性均相关.HLA-Ⅰ类基因的型别和HBV抗原的序列特点,共同决定某一宿主的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC)能够引起何种HLA-Ⅰ限制性HBV特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)应答,后者是决定宿主能否有效清除肝细胞内HBV的关键因素[1].CTL表位是诱导特异性CTL克隆性增殖、分化和发挥效应的最重要的激发因素,近年来倍受重视[2].本文阐述了HBV CTL表位研究的意义、当前研究所取得的主要成绩和不足,并对表位鉴定方法的进展进行了简评.

HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)C区热点变异S87G和 (或 )I97L对细胞毒T细胞表位形成的影响。方法 以我国C基因型HBVDNA参照序列为标准 (EMBL :Y1885 5 1885 8) ,在计算机预测I97L和 (或 )S87G变异对HLA A 0 2 0 1限制性表位影响的基础上 ,利用基因工程制备的HLA A 0 2 0 1轻链、重链多肽在体外只能与相应表位短肽形成稳定复合物的特点 ,对预测到的可疑表位肽段进行验证。结果 I97L时 ,肽段HBcAg 96 10 5 (KLRQLLWFHI)的DC50比正常 (KIRQLLWFHI)时大 5倍以上 ;S87G无影响 ;I97L、S87G没有协同作用。人工合成该短肽在体外不能与HLA A 0 2 0 1轻、重链多肽形成稳定复合物。结论 HBV/C基因I97L和 (或 )S87G变异时 ,没有新的HLA A 0 2 0 1限制表位产生。

HBcAg18-27V/I变异体与严重乙型肝炎活动的关系

目的探讨人白细胞抗原(HLA)-A2限制性细胞毒T淋巴细胞(CTL)表位HBcAg18-27V/I变异体与乙型肝炎活动的关系。方法收集77例严重乙型肝炎活动(SHB)患者和88例慢性乙型肝炎(CHB)患者的血标本,提取其中的HBV DNA,PCR扩增测序HBcAg18-27表位编码区、HBV基因型并鉴定HLA-A2。随访SHB患者至少3个月,在随访时间点留取血标本,提取其中的HBV DNA,PCR扩增测序HBcAg18-27表位编码区,并收集单个核细胞(PBMC)行五聚体染色检测HBcAg18-27表位特异性CD8+记忆T细胞的频数。结果 SHB组HBcAg18-27V的检出率为23.4%(18/77)、CHB组为4.5%(4/88),两组相比,P<0.01。随访存活的10例HBcAg18-27V SHB患者(1例PCR扩展阴性),其中4例HLA-A2阳性患者HBcAg18-27V变异为HBcAg18-27I,而5例HLA-A2阴性者随访后仍检测到HBcAg18-27V。HBcAg18-27V特异性CD8+记忆T细胞的频数高于HBcAg18-27I者。结论在HLA-A2阳性的SHB患者中,发生HBcAg18-27V向HBcAg18-27I表位漂移是HBcAg18-27V诱导的CTL免疫反应的结果;而CTL免疫反应在清除HBcAg18-27V病毒的同时,也参与了HBV相关SHB活动的发生。

HBV/C热点变异对HLA—A2限制性T细胞表位的影响

乙型肝炎病毒(HBV)变异与人体特异性免疫应答的之间的关系,是阐明变异的生物意义的关键之一,但受方法学的限制迄今所知甚微[1].应用计算机表位预测和人白细胞抗原(HLA)肽复合物技术,分析了我国HBV慢性感染者C基因热点变异I97L和(或)S87G对HLA-A2限制性T细胞表位的影响.

HLA- A0201、A1101和A2402限制性HBV抗原肽的虚拟预测与实验鉴定

目的:筛选和鉴定基因总频率>50%的3种人类白细胞抗原(HLA)(A0201、A1101和A2402)分子限制的乙型肝炎病毒(HBV)抗原T细胞表位肽。方法:利用6种在线T细胞表位肽预测数据库,针对乙肝病毒表面抗原、核心抗原、DNA多聚酶和X蛋白等4种抗原,虚拟筛选3种HLA-A分子限制的T细胞表位肽。从南京市第二医院检验科收集乙型肝炎住院患者的外周抗凝血,制备外周血单个核细胞,通过γ干扰素酶联免疫斑点法(IFN-γELISPOT)筛选出对任何一组混合多肽呈现特异T细胞反应的乙型肝炎患者;重新采集这些乙型肝炎患者的新鲜外周血,用IFN-γELISPOT法鉴定混合肽中单种抗原肽的免疫原性;并采用聚合酶链反应测序分型法对这些乙型肝炎患者进行HLA-A等位基因分型。结果:经鉴定具有免疫原性的HLA-A0201分子限制性HBV表位肽8种,A1101限制性HBV表位肽6种,A2402限制性HBV表位肽7种。结论:本研究筛选鉴定了3种HLA-A分子限制的4种HBV抗原的21种T细胞表位肽,其中11种未见报道,而且HLA-A1101分子限制性表位肽的免疫原性明显弱于HLA-A0201和A2402分子限制性表位肽。