羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达

目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-MHBst和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1(-)-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。

乙型肝炎病毒MHBs^(t155)蛋白促进肝癌细胞HepG2生长的实验研究

目的研究乙型肝炎病毒羧基末端155位截短的中表面蛋白(MHBst155)对肝癌细胞生长、增殖的影响。方法以Hep G2细胞和稳定表达GFP/MHBst155融合蛋白的Hep G2/GFP-MHBst155作为实验细胞,细胞用5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R,20μmol/L浓度)处理。采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测细胞吸光度值A490,分析细胞生长增殖情况;流式细胞术检测细胞周期变化。结果 72 h时Hep G2细胞组和Hep G2/GFP细胞组的A490分别为(0.67±0.12)、(0.70±0.06),与Hep G2/GFP-MHBst155细胞组(1.82±0.09)比较,差异均有统计学意义(t=-27.05、-36.71,P值均<0.05),而Hep G2细胞组与Hep G2/GFP细胞组比较差异无统计学意义(t=-1.21,P=0.24)。流式细胞术检测显示Hep G2/GFP-MHBst155细胞组的G0/G1期细胞比例为(26.23±2.70),明显低于Hep G2细胞组(45.20±1.25)和Hep G2/GFP细胞组(41.83±2.14),差异均有统计学意义(t=11.03、7.84,P值均<0.05);而经5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)处理的Hep G2/GFP-MHBst155细胞组G0/G1期的比例为(43.03±1.45),与未处理Hep G2/GFP-MHBst155细胞组比较,差异有统计学意义(t=9.49,P<0.05)。结论 MHBst155可能通过缩短Hep G2细胞生长的G0/G1期而加快细胞周期进程,从而促进肝癌细胞的生长,其机制可能与MHBst155蛋白诱导生长调控基因的异常甲基化有关。