应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究

目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.

截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV )表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体 (MHBst)的反式激活功能。方法 用聚合酶链反应 (PCR)扩增截短的HBV表面抗原中蛋白 (MHBst167)基因 ,克隆至真核表达载体 pcDNA3 .1(-)中 ,转染COS 7细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞MHBst167蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pSV lacZ共转染COS 7细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶的活性。 结果 构建成含有约 5 0 0bp基因的质粒 pcDNA3 .1(-) Mt ,在COS 7细胞表达出相应蛋白 ,对pSV lacZ的表达具有反式激活作用。 结论 构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并具有反式激活功能。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr^-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原中蛋白 (MHBs)核酸疫苗的免疫原性。方法 以新型人体应用载体质粒pSW 3891构建MHBs核酸疫苗 (pSW3891 /MHBs/adr) ,对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒 (pSW 3891 )和MHBs核酸疫苗 ,采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs ,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性。结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达 ,免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs,血清阳性终点滴度达 1∶972 0 0 ,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性达 78 81 %。

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式.HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在昆虫细胞中的表达及其初步鉴定

从乙肝阳性人血清中克隆HBV含前s区表面抗原基因（PreSZ＋S），将其插入到杆状病毒转移质粒PVL1393中，并与昆虫病毒ACNPVDNA共转染Sf9昆虫细胞，筛选出重组病毒。用乙肝放免（RIA）试剂盒及EIAPreS2－Ag检测试剂盒检测重组病毒感染的Sf9细胞，表明细胞中有HBsAg及PreS2－Ag存在。将重组病毒感染的细胞免疫小鼠，在小鼠血清中能检测到anti-HBsAg及anti-PreS2抗体。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1基因的克隆及生物信息学分析

目的克隆乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)结合蛋白1(MBP1)基因,构建其真核表达载体并应用生物信息学技术初步探讨其结构及功能。方法应用PCR技术从HepG2细胞提取的cDNA扩增MBP1基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR及限制性酶切分析及测序进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位。结果成功从HepG2细胞提取并逆转录的cDNA扩增出MBP1基因,其编码区为201个核苷酸(nt),编码产物由66个氨基酸残基(aa)组成,进行GenBank同源序列搜寻发现其与已知基因序列和蛋白序列之间无显著同源性,属于未知功能的新基因,并成功进行TA克隆,经酶切和测序验证正确后亚克隆至pcDNATM3.1/myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于第12号染色体,其编码产物分子量为16645.7,理论pI为5.33,半衰期为4.4h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含潜在的2个螺旋区域和1个β折叠,预测其可能包含2个蛋白激酶C磷酸化作用位点、2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位点和2个N-豆蔻酰化位点并推测其可能具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及2个跨膜结构域。结论发现并成功克隆了乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白1(MBP1)基因,为以后研究此基因的生物学功能及其在HBV损害肝细胞等方面的具体作用提供了新线索。

血清乙型肝炎表面抗原及乙型肝炎病毒RNA水平在预测核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎患者停药后复发中的价值

目的分析乙型肝炎表面抗原(HbsAg)及乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)水平检测对核苷(酸)类药物(NAs)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者停药后复发的预测效果。方法选取2020年1月至2021年1月在赣州市人民医院使用NAs治疗并达到停药标准的80例CHB患者,展开1年随访,根据有无病毒学复发分为复发组和未复发组。采集两组患者血液标本,展开HBV RNA及HBsAg定量检测,分析HBsAg和HBV RNA定量对NAs药物停药后复发的预测价值。结果80例患者复发率17.50%,复发组的停药时HBV DNA载量、停药时HBsAg定量高于未复发组,差异有统计学意义(P<0.05)。复发组停药6、12、18、24个月,HBsAg及HBV RNA定量水平比较,停药24个月HBsAg及HBV RNA定量水平高于其他时间点,差异有统计学意义(P<0.05)。HBV RNA预测疾病复发的敏感度为85.71%,特异度80.30%,HBsAg对应数值为78.57%、89.39%。结论HBsAg和HBV RNA定量对NAs药物停药后CHB复发有预测价值,值得推广。

血清乙型肝炎病毒表面抗原水平与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸载量在不同阶段乙型肝炎病毒感染肝衰竭患者中的表达

目的分析血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)水平与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)载量在不同阶段乙型肝炎病毒(HBV)感染肝衰竭患者中的表达意义。方法回顾性选取龙岩市第二医院于2020年9月至2021年9月收治的64例HBV感染肝衰竭患者作为研究对象,按照病情阶段分为慢性肝衰竭(CLF)组35例和慢加急性肝衰竭(ACLF)组29例,两组均通过电化学发光法和荧光定量法(Q-PCR)检测血清中HBsAg和HBV-DNA水平,并比较两组的因子表达情况。结果ACLF组中的HBsAg与HBV-DNA水平以及CD4+、CD8+均高于CLF组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论临床可通过分析患者血清中的HBsAg与HBV-DNA水平的表达情况,掌握不同病程阶段HBV感染患者的病情进展情况,为病症的预防和干预治疗提供参考依据。

N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的表达及免疫原性的影响

目的:研究N-糖基化移位对乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗体外蛋白表达及小鼠体内体液免疫及细胞免疫应答的影响。方法:通过基因工程中定点突变技术,将乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)中第4位氨基酸上连接的糖链去除,或将糖链依次移位至第5、6或7位氨基酸,来构建N-糖基化去除及移位的核酸疫苗,分别命名为Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7。用上述核酸疫苗与野生型MHBs核酸疫苗(pSW3891/MHBs/Adr,简称Adr)及空载体质粒pSW3891分别用脂质体瞬时转染293T细胞,应用蛋白印迹法检测MHBs的表达。采用肌肉注射法,以各组疫苗分别对BALB/c小鼠于第0、2、4和6周进行免疫,用ELISA法检测小鼠血清中抗-HBs抗体、ELISPOT法检测小鼠表面抗原多肽特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量。结果:蛋白印迹法结果显示Adr、Adr-dN4、Adr-N4-5、Adr-N4-6、Adr-N4-7体外转染293T细胞后,均可以在293T细胞内表达,且Adr、Adr-N4-5、Adr-N4-7可将表达产物分泌到细胞外。ELISA及EISPOT结果表明:Adr免疫组小鼠抗-HBs终点滴度及表面抗原特异性分泌IFN-γ的脾细胞数量,均略高于其他免疫组小鼠,但与Adr-N4-5、Adr-N4-7相比无统计学差异(P>0.05),与Adr-dN4和Adr-N4-6组相比有显著的统计学差异(P<0.05)。结论:在第5或7位氨基酸附加N-连接糖链,能修补或替代Asn4连接糖链引导MHBs分泌的功能。HBs表达蛋白分泌到细胞外对诱导机体产生特异性细胞和体液免疫是至关重要的。

乙型肝炎病毒表面抗原清除影响因素的研究进展

近年来,随着各种抗病毒药物的使用及乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)疫苗和母婴阻断的广泛普及,慢性乙型肝炎(CHB)的防治取得了显著进步。但数据显示,2019年全球一般人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)流行率为3.8%,约有150万新发HBV感染者,2.96亿慢性感染者,82万人死于HBV感染相关疾病[1],HBV感染仍然是全球范围内威胁人类健康的重大公共卫生问题。但研究也表明HBsAg清除后持久性佳,复发率低,乙肝相关不良事件(肝癌、失代偿肝硬化、肝移植和/或死亡)发生率也显著下降[2],并且HBsAg清除是CHB患者最接近临床治愈[持续病毒学应答且HBsAg阴转伴或不伴有抗-HBs阳转、丙氨酸转氨酶(ALT)正常、肝组织病变轻微或无病变]的一个指标。而寻找有利于HBsAg清除的相关因素进行个体化治疗提高临床治愈率一直是临床关注的热点问题。因此本文主要从宿主、病毒、治疗方案等角度对与HBsAg清除有关的相关因素进行概述。

血清类粘蛋白2下调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ转录活性的研究

目的:探讨血清类粘蛋白2(ORM2)对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV-SP Ⅰ)转录的激活作用. 方法:以我实验室前期得到的HBV-SP Ⅰ的酵母单杂交系统筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定ORM2的基因编码区域,聚合酶链反应(PCR)扩增ORM2编码基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)- ORM2载体;将该质粒与SP Ⅰ的氯霉素乙酰转移酶(CAT) 报告载体pCAT3-SP Ⅰ共转染肝癌细胞系HepG2细胞系, 并以pCAT3-SP Ⅰ单独转染HepG2细胞系作为对照,酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性. 结果:pCAT3-SPⅠ在HepG2细胞中能够启动CAT的表达; 共转染实验pCAT3-SP Ⅰ+pcDNA3.1(-)-ORM2组CAT 的表达活性较pCAT3-SP Ⅰ下降了81.9%. 结论:OKM2蛋白具有对HBV-SP Ⅰ的反式抑制作用.本实验验证了我室利用酵母单杂交技术筛选HBV-SP Ⅰ特异结合蛋白的结果,为进一步了解HBV-SP Ⅰ的转录调控机制及其与SP Ⅰ结合的反式作用因子提供了新的线索.

转基因中国地鼠卵巢细胞B43系分泌的乙型肝炎病毒表面抗原颗粒中gp30的分子组成

使用生化和免疫沉淀方法,对转基因CHO细胞B43系分泌的乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)颗粒在SDS-PAGE上出现的30kD多肽,进行了分子组成的研究。首先用蛋白转移抗体酶染方法证明是特异性HBsAg,再用糖染色法证明是糖蛋白,以gp30命名之。观察到,随纯化产品在4℃保存时间的延长,gp30逐渐消失,说明gp30不够稳定。含gp30的样品经过胰酶消化后的电泳带形和血源HBsAg对照者基本相同。放射免疫沉淀试验发现细胞内的目的基因的翻译产物只有p23,其后逐步合成gp25、gp27及gp30。用衣霉素抑制或用内源性糖苷酶-F处理的样品,gp27的糖链消失,形成p23;而gp30的一个与gp27相同的糖链也消失,从而形成“gp27”,说明gp27及gp30中均有一个-N-连接的糖链。而在gp30中尚有另一种不受衣霉素和糖苷酶-F处理影响的、由-O-连接的糖基,由此形成“gp27”。分析工程细胞在合成、运输及分泌过程中逐步形成p23、gp25、gp27和gp30,后者是由p23双糖化而成。

无症状乙型肝炎病毒携带者中乙型肝炎表面抗原半定量检测的意义

目的研究无症状乙型肝炎病毒（HBV）携带者中HBV表面抗原（HBsAg）含量与HBV复制的相关性。方法采集HBV携带者血清152例,应用电化学发光法检测HBsAg含量[以标本吸光度值与仪器所给临界值（Cut-off）的比值勤（COI）表示]、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测HBV e抗原（HBeAg）、聚合酶链反应（PCR）检测HBV DNA。按照HBV DNA检测结果将病例分为4组。Ⅰ组（54例）、Ⅱ组（34例）HBV DNA水平分别为〈103拷贝/mL、103-105拷贝/mL,两组HBeAg皆为阴性;Ⅲ组（32例）HBV DNA水平为105-107拷贝/mL,其中HBeAg阳性8例,阴性24例;Ⅳ组（32例）HBV DNA水平〉107拷贝/mL,HBeAg皆为阳性。结果HBsAg含量与HBV DNA水平呈显著对数相关（r=0.623,P〈0.001）。各组平均Log HBsAg COI分别为Ⅰ组2.65±0.85,Ⅱ组2.95±0.76,Ⅲ组3.19±0.49,Ⅳ组4.65±0.37,其中Ⅳ组显著高于其他任何一组（P〈0.001）;Ⅰ组显著低于Ⅲ组（P=0.001）。根据受试者工作特征（ROC）曲线,Ⅳ组鉴别于其他各组的最佳分界值为HBsAgCOI=9 250（敏感性96.9%,特异性90.8%）;而Ⅰ组鉴别于其他各组的最佳分界值为HBsAgCOI=1 250（敏感性68.5%,特异性62.5%）。结论HBsAg含量的检测在临床上判断HBV复制方面不失为一种即经济又简便的PCR替代方法。

乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达

目的提高乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）在人参愈伤组织细胞中的表达。方法构建一种植物细胞表达载体pBIBeo,该载体携带CaMV 35S双增强启动子和TMV（U1株）翻译增强子。用pBIBeo转化的农杆菌LBA4404与人参愈伤组织细胞共培养,经G418筛选获得新生抗性细胞团PBIBeo,连续继代培养选育出用于植物源口服乙肝疫苗生产的高产细胞株。提取基因组DNA和mRNA,进行PCR和RT-PCR鉴定,Western blot鉴定HBsAg的特异性,电镜下观察纯化抗原颗粒大小,并以ELISA检测HBsAg的表达水平。结果转化的人参细胞基因组DNA进行PCR反应,得到约700 bp的启动子基因片段。提取mRNA进行RT-PCR反应,得到约700 bp的HBsAg基因片段。Western blot分析可见相对分子质量为24 000的特异性条带。亲和层析纯化细胞表达的HBsAg抗原,电镜观察可见平均直径为32 nm的颗粒。ELISA检测结果表明pBIBeo转化细胞株HBsAg表达量比pBIBSa转化细胞株提高1~2倍。结论人参细胞基因组已经整合了目的基因并稳定高效表达。

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。