血清乙型肝炎表面抗原及乙型肝炎病毒RNA水平在预测核苷(酸)类药物治疗慢性乙型肝炎患者停药后复发中的价值

目的分析乙型肝炎表面抗原(HbsAg)及乙型肝炎病毒RNA(HBV RNA)水平检测对核苷(酸)类药物(NAs)治疗慢性乙型肝炎(CHB)患者停药后复发的预测效果。方法选取2020年1月至2021年1月在赣州市人民医院使用NAs治疗并达到停药标准的80例CHB患者,展开1年随访,根据有无病毒学复发分为复发组和未复发组。采集两组患者血液标本,展开HBV RNA及HBsAg定量检测,分析HBsAg和HBV RNA定量对NAs药物停药后复发的预测价值。结果80例患者复发率17.50%,复发组的停药时HBV DNA载量、停药时HBsAg定量高于未复发组,差异有统计学意义(P<0.05)。复发组停药6、12、18、24个月,HBsAg及HBV RNA定量水平比较,停药24个月HBsAg及HBV RNA定量水平高于其他时间点,差异有统计学意义(P<0.05)。HBV RNA预测疾病复发的敏感度为85.71%,特异度80.30%,HBsAg对应数值为78.57%、89.39%。结论HBsAg和HBV RNA定量对NAs药物停药后CHB复发有预测价值,值得推广。

应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白上调c-myc基因表达的研究

目的:应用抑制性消减杂交方法构建截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式调节基因的消减文库,用免疫印迹方法验证截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白对c-myc基因的上调表达.方法:构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白的真核表达载体pcDNA3.1(-)-Mt,分别以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-Mt和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,用抑制性消减杂交技术,将实验组与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.生物信息学分析结果显示部分与肿瘤发生密切相关的基因,如癌基因c-myc.结果:显示截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白可以反式激活c-myc基因,并上调其表达.结论:成功构建截短型乙肝病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的消减文库,细胞原癌基因c-myc是MHBst反式激活作用的靶基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础.

截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的初步研究

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV )表面抗原中蛋白羧基末端缺失突变体 (MHBst)的反式激活功能。方法 用聚合酶链反应 (PCR)扩增截短的HBV表面抗原中蛋白 (MHBst167)基因 ,克隆至真核表达载体 pcDNA3 .1(-)中 ,转染COS 7细胞 ,酶联免疫吸附法 (ELISA)检测细胞MHBst167蛋白的瞬时表达 ;与报告质粒 pSV lacZ共转染COS 7细胞 ,检测 β 半乳糖苷酶的活性。 结果 构建成含有约 5 0 0bp基因的质粒 pcDNA3 .1(-) Mt ,在COS 7细胞表达出相应蛋白 ,对pSV lacZ的表达具有反式激活作用。 结论 构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达 ,并具有反式激活功能。

乙型肝炎病毒表面抗原清除影响因素的研究进展

近年来,随着各种抗病毒药物的使用及乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)疫苗和母婴阻断的广泛普及,慢性乙型肝炎(CHB)的防治取得了显著进步。但数据显示,2019年全球一般人群乙肝病毒表面抗原(HBsAg)流行率为3.8%,约有150万新发HBV感染者,2.96亿慢性感染者,82万人死于HBV感染相关疾病[1],HBV感染仍然是全球范围内威胁人类健康的重大公共卫生问题。但研究也表明HBsAg清除后持久性佳,复发率低,乙肝相关不良事件(肝癌、失代偿肝硬化、肝移植和/或死亡)发生率也显著下降[2],并且HBsAg清除是CHB患者最接近临床治愈[持续病毒学应答且HBsAg阴转伴或不伴有抗-HBs阳转、丙氨酸转氨酶(ALT)正常、肝组织病变轻微或无病变]的一个指标。而寻找有利于HBsAg清除的相关因素进行个体化治疗提高临床治愈率一直是临床关注的热点问题。因此本文主要从宿主、病毒、治疗方案等角度对与HBsAg清除有关的相关因素进行概述。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0引言 乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关[1-5].

血清类粘蛋白2下调乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ转录活性的研究

目的:探讨血清类粘蛋白2(ORM2)对乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV-SP Ⅰ)转录的激活作用. 方法:以我实验室前期得到的HBV-SP Ⅰ的酵母单杂交系统筛选结果为基础,利用生物信息学技术确定ORM2的基因编码区域,聚合酶链反应(PCR)扩增ORM2编码基因,克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,构建pcDNA3.1(-)- ORM2载体;将该质粒与SP Ⅰ的氯霉素乙酰转移酶(CAT) 报告载体pCAT3-SP Ⅰ共转染肝癌细胞系HepG2细胞系, 并以pCAT3-SP Ⅰ单独转染HepG2细胞系作为对照,酶联免疫吸附法(ELISA)检测CAT的表达活性. 结果:pCAT3-SPⅠ在HepG2细胞中能够启动CAT的表达; 共转染实验pCAT3-SP Ⅰ+pcDNA3.1(-)-ORM2组CAT 的表达活性较pCAT3-SP Ⅰ下降了81.9%. 结论:OKM2蛋白具有对HBV-SP Ⅰ的反式抑制作用.本实验验证了我室利用酵母单杂交技术筛选HBV-SP Ⅰ特异结合蛋白的结果,为进一步了解HBV-SP Ⅰ的转录调控机制及其与SP Ⅰ结合的反式作用因子提供了新的线索.

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及其产物活性的初步检测

构建了pSV2DHWS2S质粒,使dhfr扩增基因及乙型肝炎病毒的Pre-S_2+S基因分别在两个SV40早期启动子的调控之下。此质粒转化到CHO-dhfr^-细胞,经克隆、加氨甲喋呤(MTX)筛选、扩增,建立了3个高效分泌HBsAg中蛋白及主蛋白的克隆细胞系。检测了其中的M6细胞系生物学特性。结果表明,免疫电镜下可观察到22nm的颗粒;该细胞用转瓶连续培养60天,每2天收、换液1次,每升HBsAg平均产量为2.9mg。经初步纯化,在SDS-PAGE中显示23k、27k主蛋白带及33k、36k中蛋白带。主蛋白及中蛋白的反相血凝(RPHA)滴度分别为64和128;中蛋白的ELISA滴度为320。部分品系小鼠免疫后能产生滴度为8的抗Pre-S_2抗体。3只家免中仅有1只在免疫后第1、2周可测出Pre-S_2抗体,而3只兔的S抗体滴度都较高,持续时间也较长。

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活基因1的克隆化研究

目的:研究乙型肝炎病毒(HBV)羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)的反式激活作用,利用差异显示技术,筛选克隆MHBst蛋白的反式激活作用的靶基因,发现新型基因,为阐明MHBst对于肝细胞表达基因谱的影响,探索新的研究方向。方法:利用多聚酶链反应技术(PCR)扩增MHBst的编码基因片段,构建真核表达载体pcDNA3.1-MHBst,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与仅转染空白载体pcDNA3.1的HepG2细胞进行差异显示,利用抑制性消减杂交技术(SSH)克隆鉴定MHBst的反式激活作用的靶基因,通过生物信息学技术,确定新基因的序列,设计序列特异性引物,利用HepG2细胞来源的mRNA进行逆转录PCR(RT-PCR)扩增,克隆新基因,并对于新基因的序列以及编码基因产物序列进行分析。利用生物信息学技术确定TTP1基因是新基因。结果:构建表达载体pcDNA3.1-MHBst,经过序列分析和酶切鉴定正确。转染HepG2细胞系,利用SSH技术获得差异表达的基因片段。经对于美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列的数据库(GenBank)检索,证实这是一个新型基因片段。通过对于同源基因序列的比对,根据Kozak规则和终止密码子下游的多聚腺苷酸信号序列,确定新基因的序列,将这种MHBst反式激活的新基因命名为TTP1,并在GenBank中注册登录。结论:克隆并鉴定了乙型肝炎病毒羧基末端截短型表面抗原中蛋白反式激活作用的新型靶基因TTP1,为今后研究MHBst的反式激活作用,开辟了新的研究方向和可能。

血清乙型肝炎病毒表面抗原水平与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸载量在不同阶段乙型肝炎病毒感染肝衰竭患者中的表达

目的分析血清乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)水平与血清乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)载量在不同阶段乙型肝炎病毒(HBV)感染肝衰竭患者中的表达意义。方法回顾性选取龙岩市第二医院于2020年9月至2021年9月收治的64例HBV感染肝衰竭患者作为研究对象,按照病情阶段分为慢性肝衰竭(CLF)组35例和慢加急性肝衰竭(ACLF)组29例,两组均通过电化学发光法和荧光定量法(Q-PCR)检测血清中HBsAg和HBV-DNA水平,并比较两组的因子表达情况。结果ACLF组中的HBsAg与HBV-DNA水平以及CD4+、CD8+均高于CLF组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论临床可通过分析患者血清中的HBsAg与HBV-DNA水平的表达情况,掌握不同病程阶段HBV感染患者的病情进展情况,为病症的预防和干预治疗提供参考依据。

新型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白核酸疫苗的免疫原性研究

目的 观察新型乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原中蛋白 (MHBs)核酸疫苗的免疫原性。方法 以新型人体应用载体质粒pSW 3891构建MHBs核酸疫苗 (pSW3891 /MHBs/adr) ,对照组和实验组Balb/c小鼠分别基因枪法免疫对照载体质粒 (pSW 3891 )和MHBs核酸疫苗 ,采用酶联免疫吸附试验检测抗HBs ,LDH释放测定法检测小鼠特异性细胞毒T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性。结果 MHBs核酸疫苗可在体外高效表达 ,免疫小鼠后可产生高滴度抗HBs,血清阳性终点滴度达 1∶972 0 0 ,小鼠脾细胞HBs特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性达 78 81 %。

乙型肝炎病毒表面抗原主蛋白上调硫氧还蛋白还原酶1基因的表达

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原主蛋白(SHBs)对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法以我室构建的SHBs基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),聚合酶链反应(PCR)扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3.1(-)-SHBs共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-SHBs瞬时共转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-TXNRD1p的7.4倍,是pCAT3-TXNRD1p与pcDNA3.1(-)-empty共转染的2.5倍。结论我室克隆的TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的SHBs蛋白可以上调TXNRD1的启动子活性。

应用酵母单杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ的结合蛋白

目的:寻找与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅰ(SPⅠ)相互作用的特异性结合蛋白,进一步探讨肝细胞中的蛋白对于HBV复制和表达的调节作用,阐明其分子作用机制。方法:应用酵母单杂交体系,以3重复串连的SPⅠ核心序列为“诱饵”,对酵母细胞中的人肝细胞cDNA文库进行筛选,应用DNA序列测定及生物信息学方法对筛选出的结果进行分析。结果:共获得了12个双阳性克隆,编码10种不同的蛋白。其中有3个未知功能蛋白,其余为血清类粘蛋白2、丝氨酸脱水酶、人肝细胞生长因子样蛋白等蛋白。结论:这些蛋白在酵母细胞内SPⅠ核心序列结合,可能是作用于SPⅠ的反式作用因子,但它们对HBV-SPⅠ是否有转录调控作用,笔者正进行进一步的研究。

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1的基因克隆化研究

目的:发现了与乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ(HBV- SP Ⅰ)结合的未知功能蛋白,并克隆了他的全长基因. 方法:以SP Ⅰ核心序列为“诱饵”,应用酵母单杂交技术对人肝细胞cDNA文库进行筛选,得到了一个未知基因,命名为乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1(SBP1).结合生物信息学技术,应用分子生物学技术,克隆了SBP 1的基因编码序列. 结果:经酶切和测序鉴定,结果正确,成功克隆了SBP 1 的基因编码序列. 结论:SBP 1具有完整的开放读码框,可能通过与SP Ⅰ的结合发挥生物学作用.

慢性乙型肝炎病毒表面抗原e大蛋白检测的临床意义

目的通过检测乙型肝炎(下称乙肝)患者血清中乙肝病毒(HBV)表面抗原大蛋白(LHBS)、HBV-DNA、HBV-preS1、乙肝病毒e抗原(HBeAg),探讨LHBS与后3者的相关性及LHBS在乙型肝炎诊治中的临床意义。方法LHBS、HBV-preS1、HBeAg采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测,HBV-DNA的检测方法为荧光定量聚合酶链反应(PCR)。结果91例HBV感染者血清中,LHBS的OD值与HBV-DNA拷贝数对数值具有良好的正相关性(rs=0.652,P<0.01),LHBS与HBV-DNA、HBV-preS1、HBeAg间均相关(P<0.01),且阳性率均存在差异有统计学意义(P<0.05),LHBS的阳性率最高。在HBV-DNA阳性和HBV-DNA阴性组中,LHBS与HBeAg阳性率均存在差异有统计学意义,LHBS与HBV-preS1的阳性率在HBV-DNA阴性组中差异有统计学意义,LHBS更为敏感。在HBeAg阴性组中,LHBS与HBV-preS1、HBV-DNA的阳性率均存在差异有统计学意义,较HBV-preS1、HBV-DNA均高。结论LHBS是反映HBV感染者体内病毒复制程度的敏感、可靠指标。

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的下调基因

目的筛选与克隆乙型肝炎表面抗原大蛋白(LHBs)的下调基因,以阐明HBV感染相关性疾病的分子生物学机制。方法应用常规分子生物学方法,克隆LHBs基因,构建真核表达质粒pcDNA3．1(-)-LHBs。将 pcDNA3．1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。分别以pcDNA3．1(-)-LHBs以及pcDNA3．1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并逆转录为cDNA,来源于pcDNA3．1(-)-LHBs转染细胞的cDNA为驱动(driver),来源于pcDNA3．1(-)的cDNA为测试(tester),进行抑制性消减杂交分析,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆进行测序及同源性分析。结果①成功构建pcDNA3．1(-)-LHBs真核表达载体;②pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染HeoG2细胞的CAT 表达活性较对照组的活性明显下降(P＜0.01),抑制率达93．9％;③成功构建人LHBs下调基因的cDNA消减文库。通过生物信息学分析获得14种编码基因。结论 LHBs是HBV基因组编码的一种反式调节因子,可以下调SV40 早期启动子的活性。筛选到的LHBs下调的cDNA全长序列,包括与抗氧化防御、细胞生长调节、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,以此可以推测LHBs存在的调控机制以及HBV的致病(癌)机制。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式.HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.

乙型肝炎病毒大表面蛋白诱导内质网应激调控p27 IRES翻译活性的机制研究

目的探讨在乙型肝炎病毒大表面蛋白(LHB)诱导的内质网应激条件下,抑癌基因p275′UTR内部核糖体进入位点(IRES)的活性变化及其调控机制。方法构建双荧光素酶报告质粒,用双荧光素酶报告基因实验检测p275′UTR中IRES的活性;利用qRT-PCR和Western blotting检测LHB诱导的未折叠蛋白反应相关分子水平;RNA下拉、质谱技术和RNA免疫沉淀筛选并确认潜在的与p275′UTR结合的相关蛋白;siRNA转染建立PCBP2和ANXA2敲低细胞模型,用双荧光素酶报告基因检测在敲低PCBP2和ANXA2后p27 IRES翻译活性的变化。结果成功构建了检测p27 IRES活性的双荧光素酶报告质粒。LHB可以诱导内质网应激,同时显著提高p27的IRES翻译活性(P<0.01)。LHB过表达激活了PERK通路并提高了eIF2α的磷酸化水平,特异性PERK通路抑制剂GSK2606414使RERK和eIF2α的磷酸化水平降低,从而引起p275′UTR的IRES翻译活性显著降低(P<0.01,P<0.05)。同时,磷酸酶抑制剂Sal003能显著增加eIF2α磷酸化水平,使p27 IRES活性进一步增强(P<0.01,P<0.05)。最后,我们发现PCBP2和ANXA2作为潜在的反式作用因子可增强p27 IRES活性。结论LHB诱导的内质网应激通过eIF2α磷酸化增强p27 IRES翻译活性。反式作用因子PCBP2和ANXA2正向调控其IRES翻译活性。

乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅰ结合蛋白1反式调节基因的筛选

目的 应用表达谱基因芯片技术 ,研究乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原基因启动子DNA结合蛋白 1(SBP1)反式调节基因 ,阐明SBP1蛋白可能的分子生物学功能。方法 设计并合成SBP1基因序列特异性的引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)技术扩增SBP1基因片段 ,以常规的分子生物学技术将获得的SBP1编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) SBP1。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空表达载体pcDNA3 .1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果 构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定 ,证实准确无误。提取高质量的mRNA ,逆转录为cDNA ,进行cDNA芯片分析。在 115 2个基因容量的表达谱芯片的筛选中 ,发现有 12个基因表达水平显著上调 ,6个基因表达水平显著下调。结论 应用基因表达谱芯片成功筛选了SBP1转染细胞后差异表达基因 ,为进一步阐明SBP1蛋白可能的生物学功能提供依据。