构建表达Flag-GPI的重组乙型肝炎病毒载体

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是小型的嗜肝DNA病毒,能够特异性地感染人肝实质细胞。HBV的易感性可以归于多个方面,包括细胞表面的受体以及细胞内的蛋白或其他因子,目前对HBV易感性的了解还有待深入。本课题利用课题组原有的HBV 5c3c载体和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)的特性,构建了重组HBV载体5c3c-CD59-Flag-GPI和5c3cT-Flag-GPI,转染Huh7细胞后可以将Flag标签锚定在细胞膜上,且可利用Flag抗体通过流式细胞术对其进行分选。在回补HBV包膜蛋白的情况下,5c3cT-Flag-GPI能包装形成完整的重组HBV颗粒。本研究为后续优化重组HBV的包装效率,进而为HBV易感性研究提供工具并奠定基础。

HBV YIDD变异株真核表达载体的构建及鉴定

构建HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株的全基因真核表达载体,为进一步深入探讨乙型肝炎病毒拉米夫定耐药的分子机制,寻求耐药后的有效治疗奠定基础。以重组质粒PMD18T-HBV-C为模板,采用PCR扩增HBV C基因型YIDD变异株的全基因组DNA,并将其定向克隆于真核表达载体PcDNA3.1(+)中。获得的真核表达重组质粒PcDNA3.1(+)-HBV-C(YIDD)通过酶切后电泳及测序进行鉴定。琼脂糖电泳结果证实PCR产物大小约为3.2 kb,与预期相同。酶切及测序结果证实,HBV C基因型YIDD拉米夫定耐药株全基因真核表达载体PcDNA3.1(+)-HBV-C(YIDD)构建成功。

胶原酶Ⅱ对肝硬化大鼠的治疗作用

目的:探讨应用腺病毒与乙型肝炎病毒嵌合载体表达胶原酶Ⅱ对肝硬化大鼠模型的治疗作用.方法:以硫代乙酰胺口服法16 wk诱导大鼠形成肝硬化模型,用腺病毒穿梭质粒与乙型肝炎病毒嵌合载体表达截断的胶原酶Ⅱ基因tMMP-8片断或全长MMP-8基因,分别构建了腺病毒Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8,并以表达红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP2)的Ad-CH-RFP2作为对照,经尾静脉注射治疗已形成肝硬化模型的大鼠.结果:在Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8尾静脉注射肝硬化大鼠的体内转染研究中,转染4 wk相比于模型组,肝纤维化程度显著的减轻,肝细胞再生明显,同时伴有肝组织羟脯氨酸含量的下降(28.97μg/g±2.36μg/g vs 17.04μg/g±0.61μg/g,17.62μg/g±1.30μg/g,P<0.05),AdCH-RFP2对照组,纤维化程度同模型组类似.结论:用腺病毒与乙型肝炎病毒嵌合载体表达胶原酶Ⅱ能够有效地减轻大鼠肝纤维化程度.

重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究

目的探讨重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体的抗HBV作用。方法在逆转录病毒载体中插入两种不同类型表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元,制备重组逆转录病毒pRV-CP、pRV-CS和空载体G1Na对照,并转染HepG2.2.15细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果转染HepG2.2.15细胞后3d、5d、7d、9d和11d,pRV-CP、pRV-CS和G1Na对照组对HBsAg表达的平均抑制率分别为(28.9±4.73)%(P<0.01)、(39.3±7.04)%(P<0.01)和(2.6±3.77)%;对HBeAg表达的平均抑制率分别为(40.38±2.59)%(P<0.01)、(33.1±4.27)%(P<0.01)和(3.1±3.02)%;对HBV复制的抑制率分别为67.2%和55.8%,对照组为13.4%。只有pRV-CP组培养上清液中检测出突变型HBV颗粒。结论重组逆转录病毒能转导HBV载体表达显性阴性突变体,对HBV复制及抗原表达有抑制作用,有望用于抗HBV治疗。