M型磷脂酶A2受体抗体及免疫球蛋白IgG亚型在乙型肝炎病毒相关膜性肾病中的检测

目的通过比较原发性膜性肾病(IMN)和乙型肝炎病毒相关膜性肾病(HBV-MN)患者血清中M型磷脂酶A2受体抗体(PLA2R)水平及肾活检组织中IgG亚型沉积情况,探讨PLA2R抗体和IgG亚型对HBV-MN诊断的意义。方法应用ELISA法检测了10例IMN患者和25例HBV-MN患者血清中浓度,以同期7例微小病变肾病(MCD)患者血清检测作为阴性对照。通过免疫荧光方法检查免疫球蛋白IgG亚型在IMN和HBV-MN患者肾活检组织中的沉积。结果在IMN组,患者血清M型PLA2R抗体浓度显著高于HBV-MN组患者,分别是(15.4±7.2)和(10.3±5.7)μg/mL,差异有统计学意义(P<0.05)。IgG亚型(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)在IMN组和HBV-MN组患者肾活检组织肾小球毛细血管壁的沉积无显著性区别。结论检测血清M型PLA2R抗体水平对区分HBV-MN和IMN患者具有一定价值,而IgG亚型在HBV-MN和IMN患者肾活检组织的分布则未发现明显不同。

H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型的建立

目的建立H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠动物模型,为研究病毒致病机制提供模型动物。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,观察小鼠的症状和组织病理变化。结果 BALB/c小鼠的临床症状明显,病理变化典型。结论 H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠的疾病模型成功建立。

H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的变化和作用

目的探讨H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子的变化和作用。方法通过滴鼻的方法将H9N2亚型猪流感病毒感染BALB/c小鼠,于感染后2、4、6、10、14 d取小鼠肺组织匀浆,分别测定肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的浓度。结果实验组肺组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10在不同时间点浓度均显著高于正常对照组(P<0.05),TNF-α和IL-1β于14 d后趋于正常,而IL-6和IL-10增高持续至14d后。结论 H9N2猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤过程中炎症因子发挥重大作用,TNF-α和IL-1β起致炎作用,IL-6可能和IL-10一样,发挥抗炎作用。

2株H9N2亚型禽流感病毒的致病性

为了解从我国洞庭湖地区鸡和鸭中分离的H9N2亚型禽流感病毒的生物学特性,本研究选用具有代表性的2株病毒对SPF鸡及BALB/c小鼠进行致病性试验。结果显示：2株毒株均能使鸡感染并排毒,并且使同居鸡感染排毒,但不引起鸡明显的临床症状及死亡;2株毒株感染SPF鸡后能在鸡喉分离到高滴度病毒,明显高于泄殖腔,且排毒期主要集中于第1-7天;从感染鸡脏器中病毒复制情况看,供试的2株病毒均未在脑等组织脏器中复制,而2株病毒感染BALB/c小鼠后,在小鼠脏器中复制情况却不一致,A/CK/HuN/S4591/2011（H9N2）毒株在小鼠鼻甲及肺脏中均能检测到病毒,但是A/DK/HuN/S4111/2011（H9N2）毒株仅在小鼠鼻甲中检测到较高滴度的病毒。

乙型肝炎病毒蛋白对纤维介素基因的激活作用

纤维介素基因(fgl2)在人和小鼠的重型肝炎的发病机制中发挥重要作用.为探讨乙型肝炎病毒(HBV)编码蛋白对人纤维介素基因(hfgl2)的激活作用,构建了HBV编码蛋白C、S和X的真核表达质粒pcDNA-HBc、pcDNA-HBs和pcDNA-HBx,分别与hfgl2启动子荧光素酶报告基因质粒及β半乳糖苷酶基因质粒(-βGal)共转染到CHO细胞和HepG2细胞,采用免疫组织化学和免疫印记方法(Western blotting)鉴定病毒蛋白的表达.通过检测报告基因荧光素酶(LUC)及β半乳糖苷酶的表达活性,反映病毒蛋白对hfgl2启动子的转录激活作用.结果显示,转染了真核表达质粒的细胞均能瞬时表达相应的肝炎病毒蛋白,在CHO细胞,转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的5.4和6倍,在hepG2细胞,转染pcDNA-HBc组和pcDNA-HBx组相对荧光素酶的活性是对照组的8.7和11倍.研究表明,CHO和HepG2细胞中表达的HBV C蛋白和X蛋白均具有激活hfgl2的功能,而S蛋白则不能激活.进一步揭示了HBV病毒蛋白与宿主基因的相互作用机制.

感染两种HBV C基因亚型患者病毒变异特点比较

目的调查乙型肝炎病毒C1和C2亚型感染者的临床、病理和前C基因区的变异特点。方法运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法,并结合HBV前C/C区序列测定,对广东地区63例慢性乙型肝炎患者C基因亚型和前C区变异特点进行分析,并对两种基因亚型感染者的多项临床和病理检测指标进行比较。结果所选C1和C2亚型感染者的年龄和性别构成无差异,其肝功能指标、HBV DNA水平以及肝组织炎症活动度和纤维化分期评分也无显著性差异。在前C基因区变异方面,C1亚型毒株发生C基因核心启动子变异机率高于C2亚型,C2亚型毒株发生前C终止密码变异的机率显著高于C1亚型,但两种变异的总发生率在两种亚型间并无显著性差别。结论两种C基因亚型的临床致病性并无明显差异,但在形成HBeAg阴性HBV感染方面两种毒株会采取不同的变异模式。

p38MAPK在H9N2亚型猪流感病毒诱导小鼠急性肺损伤中的表达

为研究p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)在H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)中的表达,将180只7周龄SPF级BALB/c雌性小鼠,随机平均分成H9N2-SIV感染组(感染组)、H9N2-SIV感染+p38MAPK特异性抑制剂SB203580组(SB组)和对照组,在感染后的第2、4、6、8和14天,分别进行临床观察、肺病理组织学观察、肺中磷酸化p38MAPK分布和表达的测定。结果显示:与对照组比较,感染组和SB组小鼠均表现明显的临床症状,感染组小鼠肺磷酸化p38MAPK蛋白表达在感染后第2天即明显增强,至第6天蛋白表达达高峰,差异极其显著(P<0.01),SB203580可抑制肺组织中p38MAPK的磷酸化,SB组小鼠肺损伤程度小于感染组,表明p38MAPK能够被H9N2-SIV激活并参与ALI的发生和发展过程,p38MAPK特异性抑制剂SB203580能够减轻ALI中肺组织的病理损伤。

乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV-RNaseH)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立能稳定分泌抗乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2(HBVRNaseH1及H2)重组蛋白单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法用重组HBVRNaseH1及H2蛋白为抗原免疫BALB/c/小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经有限稀释克隆3次后制备分泌McAb的杂交瘤细胞株,并用酶免疫(EIA)法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果融合后的阳性克隆中筛选出4株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,命名为H1C6、D3;H2E2、F4。这4株McAb与HBVRNaseH1及H2重组抗原均有良好的反应性,杂交瘤培养上清的EIA抗体滴度为1∶100～1∶200,其中2株诱生的同系小鼠腹水滴度为1∶800,1∶1000。这4株McAb均为IgG1亚型。结论该McAb的制备,可为HBV感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。

H9N2亚型猪流感病毒的增殖及毒力测定

目的将H9N2亚型猪流感病毒(H9N2-SIV)进行增殖并测定其毒力。方法采用鸡胚尿囊腔增殖法,将病毒接种于10日龄SPF鸡胚进行增殖,血凝(HA)试验测定病毒液效价,Reed-Muench法测定病毒的鸡胚半数感染量(EID50)和小鼠半数致死量(MLD50)。结果经过增殖后,H9N2-SIV血凝效价为1∶256,EID50=10-6.5·0.1mL-1,MLD50=10-2.32·0.l mL-1。结论 H9N2-SIV可以作为进一步试验用病毒。

鸬源H5N2亚型禽流感病毒对鸡呈低致病性

东北农业大学和中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的研究人员2012年在我国重庆市活禽交易市场进行流行病学调查时，从鸭体内分离到1株H5N2亚型禽流感病毒（AIV），DK／CQ036／12（H5N2）。为了解该病毒的生物学特性，研究人员对其进行了全基因组分析及对SPF鸡和BALB／c小鼠的致病性试验。

重庆地区乙型肝炎病毒B/adw2和C/adrq+亚型PreS/S基因参照序列的初步建立

目的 建立重庆地区不同亚型乙型肝炎病毒 (HBV)流行株PreS S基因参照序列。方法 扩增 18例HBV慢性无症状携带者的PreS S基因 ,应用同源性分析和对齐比较等方法确定基因型 血清型 ,并选同HBV亚型的PreS S拟定参照序列。结果 9株基因型B 血清型adw2、6株基因型C 血清型adrq +、3株基因型B 血清型ayw 1;建立的重庆地区基因型B 血清型adw 2、基因型C 血清型adrq +HBV流行株PreS S参照序列 ,与华东华南、东北华南地区同亚型的参照序列比较分别有6个、13个核苷酸差异 ,均可引起 4个氨基酸差异。结论 初步建立了重庆地区HBV基因型B 血清型adw2、基因型C 血清型adrq +HBV流行株PreS

乙肝病毒前C区A1896变异与机体细胞免疫功能的关系

目的 :探讨慢性乙型肝炎患者乙肝病毒 (HBV)前C区A1896变异与机体细胞免疫水平的关系。方法 :对91例慢性乙肝患者通过流式细胞分析技术 (FCM )检测外周血T淋巴细胞亚群 ,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清细胞因子 (IFN -γ、TNF -α和IL -2)水平 ,采用聚合酶链反应 (PCR)扩增HBVDNAC基因区片段 ,并对PCR产物直接测序。结果 :发生A1896变异者49例 ,变异率为53 85 % ,随病情加重A1896变异率逐渐增加 ,以重型肝炎组最高 ;变异株组IFN -γ、TNF -α水平明显增高 ,CD8+细胞相对数逐渐下降 ,CD4+/CD8+比值逐渐升高 ,差别有统计学意义 ,而CD4+相对数及IL -2水平比较差别无统计学意义。结论 :A1896变异普遍存在于慢性乙型肝炎患者中 ,且随病情加重变异株感染率逐渐增加 ,单纯变异株的比例也随之增高 ;A1896变异株可能通过改变HBcAg 的表达及分布 ,激活大量的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)释放细胞因子 。

HLA-肽复合物研究HBV/C区变异对HLA-A2限制性表位的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)C区热点变异S87G和 (或 )I97L对细胞毒T细胞表位形成的影响。方法 以我国C基因型HBVDNA参照序列为标准 (EMBL :Y1885 5 1885 8) ,在计算机预测I97L和 (或 )S87G变异对HLA A 0 2 0 1限制性表位影响的基础上 ,利用基因工程制备的HLA A 0 2 0 1轻链、重链多肽在体外只能与相应表位短肽形成稳定复合物的特点 ,对预测到的可疑表位肽段进行验证。结果 I97L时 ,肽段HBcAg 96 10 5 (KLRQLLWFHI)的DC50比正常 (KIRQLLWFHI)时大 5倍以上 ;S87G无影响 ;I97L、S87G没有协同作用。人工合成该短肽在体外不能与HLA A 0 2 0 1轻、重链多肽形成稳定复合物。结论 HBV/C基因I97L和 (或 )S87G变异时 ,没有新的HLA A 0 2 0 1限制表位产生。

表达乙肝病毒preS2S蛋白的荷瘤小鼠模型的建立

目的:建立能表达乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,为研究HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用提供简便易行的研究模型。方法:以免疫印迹法验证SP2/0-S2S细胞中有HBVpreS2S抗原的稳定表达,将SP2/0-S2S细胞种植到BALB/c小鼠胁部皮下(荷瘤),观察能否生长成瘤,以及成瘤的时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间;以免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织HBVpreS2S抗原的表达。以不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠作为阴性对照。结果:荷瘤后3天～1周,SP2/0-S2S细胞可在小鼠皮下形成实体肿瘤,成瘤率为100%,肿瘤细胞中有preS2S抗原表达,荷瘤后小鼠的平均生存时间为16±1天;与不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠相比,成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小及生存时间差异。结论:建立了能表达HBVpreS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用于HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用的实验研究。同时也建立了不表达preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用作阴性对照。

肝胚瘤细胞株HepG2中HBx蛋白对SOCS3表达的影响及其机制

目的探讨乙型肝炎病毒X蛋白（HepatitisBvirusXprotein．HBx）对肝胚瘤细胞株HepG2表达信号抑制因子3（SOCs3）的影响及其机制方法将表达HB×蛋白的重组质粒FLl—145HBx转染HepG2细胞，以不同浓度的sRc抑制剂DP2处理转染细胞，运用Westernblot和RT—PCR技术分析HBx、SOCs3mRNA和蛋白的表达情况．并以免疫细胞化学分析转染细胞中p-SRC的表达水平结果重组质粒FLl-145HBx转染HepG2细胞后，转染细胞HB×能够表达HB×蛋白．并且细胞中SOCs3mRNA和蛋白表达水平随着HBx蛋白的表达而显著增加（P〈005）．同时p—SRC蛋白的表达增强，而sRc抑制剂PP2处理转染细胞后．随着P—SRC蛋白表达的减少SOCS3蛋白表达逐渐下降结论在肝胚瘤细胞株HepG2中．HBx蛋白很可能通过促进SRC蛋白的磷酸化而诱导SOCS3蛋白的表达。

淋球菌LOS 2C7表位筛选及其与HBc融合蛋白的原核表达

目的:将淋球菌脂寡糖的2C7表位插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的MIR区,通过原核表达系统进行融合蛋白的表达,以期获得高免疫原性的淋球菌亚单位疫苗的候选靶位。方法:通过间接ELISA法,以CMCC29403菌株的LOS为包被抗原,对7个表位进行筛选;并通过杀菌试验检测肽段免疫动物产生血清的保护力。对已筛选好的肽段基因进行人工合成,通过重叠PCR将肽段基因嵌入HBc基因中,以增强表位的免疫原性,并进行原核表达。结果:初步研究表明了表位PEP1,PEP2,PEP7具有较强的脂寡糖(LOS)的免疫原性,能够模拟脂寡糖的抗原性。这3个肽段可能成为候选疫苗亚单位。通过重叠PCR方法:成功地将PEP1,PEP2,PEP7三个表位基因序列插入乙型肝炎病毒核心抗原(HBc)的刺突(MIR)部位,构建了HBc-PEP1,HBc-PEP2,HBc-PEP7融合基因,通过PET22b(+)载体进行原核表达,为下一步疫苗的研究奠定了基础。结论:2C7表位PEP1,PEP2,PEP7具有较强的脂寡糖(LOS)的免疫原性,能够模拟脂寡糖的抗原性。表位与HBc的融合蛋白可以通过原核表达系统进行可溶性表达,为下一步疫苗的研究奠定基础。

血清Lp-PLA2、Cys-C水平与HBV感染肝硬化患者Child-Pugh分级的关联性

目的检测乙型肝炎病毒(HBV)感染肝硬化患者血清脂蛋白相关磷脂酶A2(LpPLA2)、胱抑素C(CysC)水平,并分析其与ChildPugh分级、肝硬化程度的相关性。方法选取2020年8月至2022年10月平顶山市第一人民医院收治的153例HBV感染者为研究对象,其中肝硬化者86例(设为肝硬化组),乙型肝炎者67例(设为肝炎组),另选取同期于本院体检的健康志愿者51例作为对照组。比较各组受检者的血清LpPLA2、CysC、肝功能指标[碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)]水平,同时比较不同HBVDNA载量患者的血清LpPLA2、CysC水平。采用Pearson法分析血清LpPLA2、CysC水平与肝功能指标相关性,并采用Spearman法分析其与ChildPugh分级、肝硬化程度的相关性。采用受试者工作特征曲线(ROC)及曲线下面积(AUC)评价血清LpPLA2、CysC对肝硬化所致原发性肝癌的诊断价值。结果肝硬化组、肝炎组、对照组受检者的血清LpPLA2水平分别为(296.34±48.78)ng/mL、(204.19±38.06)ng/mL、(101.28±23.76)ng/mL,CysC水平分别为(1.49±0.29)mg/L、(0.92±0.20)mg/L、(0.67±0.13)mg/L,ALP水平分别为(175.24±38.41)U/L、(122.92±30.97)U/L、(71.08±20.69)U/L,GGT水平分别为(188.93±52.97)U/L、(96.37±22.12)U/L、(20.31±5.77)U/L,GLO水平分别为(40.78±9.59)g/L、(33.09±8.03)g/L、(18.85±4.28)g/L,ALB水平分别为(26.30±5.77)g/L、(39.75±9.25)g/L、(48.74±10.24)g/L,肝硬化组患者的血清LpPLA2、CysC、ALP、GGT、GLO水平明显高于肝炎组和对照组,且肝炎组明显高于对照组,而血清ALB水平明显低于肝炎组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);随着HBVDNA载量增加,血清LpPLA2、CysC水平呈上升趋势,且差异均有统计学意义(P<0.05);经Pearson法、Spearman法分析结果显示,血清LpPLA2、CysC水平与ALP、GGT、GLO、ChildPugh分级、肝硬化程度均呈正相关(P<0.05),而与ALB呈负相关(P<0.05);经ROC分析结果显示,血清LpPLA2、CysC联合鉴别诊断肝硬化程度的AUC大于单独指标鉴别诊断(P<0.05)。结论HBV感染肝硬化患者血清LpPLA2、CysC水平升高,且与ChildPugh分级、肝硬化程度密切相关,联合检测其水平对肝硬化所致原发性肝癌具有一定诊断价值。

HBV S基因亚型与前C基因1896位点变异关系的初步研究

目的:研究HBV S基因亚型与前C基因1896位点变异的关系。方法:对104例病人血清用PCR技术特异性扩增前C基因1896位点突变和用PCR-RFLP技术对HBV S基因分型。结果:①1896位点变异检出率为63.46％;②武汉地区HBVS基因亚型Ⅰ感染率为68.27％,亚型Ⅱ为25.00％,亚型Ⅲ为4.81％,亚型Ⅰ+Ⅱ复合感染为1.92％;③在亚型Ⅱ中,单纯野生株感染为80.77％,单纯变异株为7.7％,野生株变异株同时感染为11.54％,而占感染多数的亚型Ⅰ中,野生株和变异株的感染无差异。结论:1896位点是高频率变异位点,其变异不是随机的,而是与HBV不同的S基因亚型有关,基因亚型Ⅱ不易发生1896位点变异,受感染的机体内环境只是起促进变异的作用。

乙型肝炎病毒前C区、C启动子区、前S2区基因突变与慢性肝病的相关性

近年研究发现，乙型肝炎病毒（HBV）前C区nt1896位G→A、C启动子区（CP）nt1762、nt1764双突变、以及前S区基因突变与慢性肝炎患者病情活动和慢性化、疾病严重程度有一定关系。为此，我们分别检测无症状HBV携带者、慢性乙型肝炎患者、肝硬化患者血清HBV DNA基因序列，对前C、CP、前S2区域的突变情况与HBV不同感染状态的关系作一探讨。