乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品的研制

目的建立乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,确定其质量标准。方法通过对24份病原体培养物的复核、确证,全基因组测序及基因分型,组成乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品,经多家实验室的协助标定,确定参考品的质量标准,并对参考品进行均匀性及稳定性评估。结果乙型脑炎病毒核酸检测试剂国家参考品由10份阴性、14份阳性、1份最低检出限和1份精密度样品组成。质量标准为10份阴性参考品应均检出阴性;14份阳性参考品应至少检出13份阳性;精密度考品重复检测10次,要求均为乙型脑炎病毒阳性,且其检测值的CV应不大于5.0%;最低检出限参考品要求1∶102倍稀释及以上浓度时应为乙型脑炎病毒阳性。参考品的均匀性及稳定性均符合要求。结论该参考品可用作乙型脑炎病毒核酸检测试剂的质量控制及评价。

乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析

共表达γ干扰素的乙型脑炎病毒与猪细小病毒核酸疫苗的构建及其免疫原性研究

为了构建和筛选良好的猪乙型脑炎和猪细小病毒的核酸疫苗,并提高核酸疫苗的免疫效果,用重叠PCR法把PPV VP2和JEV E10连接,再将扩增的IFN-γ连入构建载体pcDNA.VEI使其共同表达。用脂质体将pcDNA.VEI介导入Vero细胞,通过间接免疫荧光法检测目的基因的体外表达。用pcDNA.VEI和不表达IFN-Κ的pcDNAZ.VE分别免疫Balb/c小鼠,同时设立PBS、猪细小病毒灭活疫苗、乙型脑炎弱毒疫苗和pcDNA3.1空白质粒免疫对照组。共免疫两次,间隔2周检测免疫指标。结果表明,通过鉴定核酸疫苗的构建达到了预期目标,并可在荧光显微镜下观察到了其转染的Vero细胞。该核酸疫苗能够诱导脾淋巴细胞增殖。ELISA结果显示,与pcDNA.VE和阴性对照组进行比较,pcDNA.VEI所诱导产生的两种抗体都较高。pcDNA.VEI组能较稳定的诱导产生T细胞亚群,并检测到CD4+/CD8+比例于首免2周后都高于pcDNA.VE。因此表明该核酸疫苗能产生特异诱导体液免疫和细胞免疫且是安全的,证明了IFNγ基因具有免疫增强效果,为乙脑和猪细小病毒核酸疫苗研究提供了实验依据。

乙型脑炎病毒寡核苷酸基因芯片研究

目的:制备检测乙型脑炎病毒寡核苷酸(oligo)基因芯片。方法:应用生物信息学软件设计60-meroligo探针用于制备基因芯片,乙型脑炎病毒(JEV)基因片段经限制性显示技术扩增标记,用于芯片杂交,清洗和干燥后对芯片进行扫描和数据分析。结果:大部分oligo探针都能特异性与相应样品杂交,呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。结论:实验中建立的oligo基因芯片检测病原体方法可行,具有应用于临床诊断的前景。

猪乙型脑炎病毒的PrM-E基因克隆与测序

通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒主要抗原基因PrM-E,并将PrM-E基因克隆及测序后,与GenBank发表的SA14-14(M18370)基因序列进行比较分析,发现试验毒株与乙型脑炎病毒SA14-14毒株的同源性为98%。在乙型脑炎病毒基因组决定乙型脑炎病毒抗原性的PrM-E的2 000 bp序列中,试验毒株与SA14-14株有35个碱基不同,但却不影响它的功能。

乙型脑炎病毒分离株PrM/E基因测序和SA14、SA14-14-2的序列比较

该研究通过RT-PCR扩增乙型脑炎病毒分离株PrM/E基因测序后,将测序结果与GenBanK发表的JEV SA14基因序列和SA14-14-2进行比较分析,结果发现分离株与JEV SA14强毒株的同源性为98.1%,与SA1-14-2株的同源性为97.1%;在477-2477长为2000nt决定JEV抗源性的PrM/E区中,分离株与SA14株仅有40个碱基不同,其中12个碱基为错义突变,导致E基因2个氨基酸序列(E135和E232)与SA14的E区两个氨基酸的不同;而分离株与SA14-14-2株有48个碱基不同,导致E基因12个氨基酸序列与SA14-14-2不同。由于确定JEV毒性的10个关键性基酸的位置均在E蛋白上,分离株与SA14强毒株这10个氨基酸的位置完全一致,因此序列的比较结果表明;乙脑病毒分离株为强毒株。由此可以看出基因分析对于病毒毒力的判断具有重要参考意义。

猪乙脑病毒WHe株的PrM-E、NS1、E-NS2A基因的克隆及序列测定

本文通过RT_PCR扩增了猪乙型脑炎病毒WHe株主要抗原基因NS1(约 1.14kb)、prM_E(约 2 .1kb)、E_NS1_NS2A (约 3.0kb) ,并将NS1、E_NS1_NS2A、PrM_E基因克隆、测序。与Genbank发表的JEV基因序列进行序列分析 ,发现WHe株与其他 12种典型的JEV强毒株的同源性在 88.3%～ 99.4 %之间。WHe株与K94P0 5株的同源性最低 (88.3% ) ,与P3株的同源性最高 (99.4 % ) ,可认为WHe株是由P3株衍生而来的。在JEV基因组 5’端 389～ 3910的长 35 2 2nt的决定JEV抗原性的C_prM_E_NS1_NS2A区中 ,WHe株与P3株仅有 2 1个碱基不同 ,其中的 14个单碱基突变为同义突变 ,另外7个为错义突变 ,导致相应的氨基酸序列 (1173个 )中的 6个氨基酸发生了变异 ,其中的 5个氨基酸变异出现在含有各关键的抗体中和决定簇的E蛋白内 ,另一个位于NS1蛋白内。

乙脑病毒CN株PrM/E基因的克隆及序列分析

通过RT -PCR扩增乙型脑炎病毒CN株主要抗原基因PrM /E ,并将PrM /E基因克隆、测序后 ,与GenbanK发表的JEVSA14 (U14 16 3)基因序列进行比较分析 ,发现CN株与JEVSA14强毒株的同源性为 98%。在JEV基因组 5′端 4 77～ 2 4 77的长 2 0 0 0nt的决定JEV抗原性的PrM /E区中 ,CN株与SA14株有 4 0个碱基不同 ,其中 2 8个碱基突变为同义突变 ,另外 12个为错义突变 ,导致相应的氨基酸序列 (6 6 6个 )中的 4个氨基酸发生了突变 ,其中有 2个氨基酸出现在含有关键的抗原决定簇的E蛋白内 。

乙型脑炎核酸疫苗的研究进展

流行性乙型脑炎（epidemic encephalitis）是由黄病毒科（flaviridae）黄病毒属乙型脑炎病毒引起的一种严重威胁人畜健康的急性中枢神经系统传染病，是重要的人畜共患病及虫媒病毒病。该病对猪的致死率不高，但能引起怀孕母猪发生流产、产死胎和木乃伊胎，公猪发生睾丸炎，育肥猪持续高热，仔猪常呈脑炎症状，对养猪业危害严重。目前，预防乙型脑炎病毒感染的疫苗有灭活疫苗和减毒活疫苗，但灭活疫苗存在注射剂量大、效果不稳定、免疫力不持久等不足；我国研制的减毒活疫苗虽然保护性好，但活苗有可能出现毒力反强、带毒、排毒、垂直传播、核酸重组等现象，而且通过常规的血清学方法检查一般与自然感染无法区分；因此，人们设法利用生物技术开发新型基因工程疫苗以克服现有疫苗的缺点。核酸疫苗作为疫苗家族的新成员有许多优点，笔者仅就乙型脑炎病毒核酸疫苗的研究现状作一综述。

JEV分子生物学与新型疫苗研究进展

流行性乙型脑炎病毒 ( Japanese en-cephalitis virus,JEV) ,是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒。本文对 JEV的基因组结构、结构蛋白、非结构蛋白及其功能、重组活疫苗和核酸疫苗的研究现状以及与常规疫苗相比所具有的优缺点等方面进行了较为详尽的综述 ,并且提出 JEV复制的确切机制及其蛋白尤其是非结构蛋白的结构与功能尚需深入研究 ,以期为进一步改良

规模猪场疾病综合防治

随着社会的不断进步,人们对猪肉食品质量的要求也越来越高。为满足人们日益增长的物质生活,逐步同国际接轨,各级领导高度重视无公害生猪基地建设。一些龙头企业,为提高自己的品牌,让自己的产品进入国际市场,也开始建立安全可靠的生猪基地,走龙头企业+基地,产、供、销一体化的生猪产业化路子。从发展的趋势来看,生猪生产将面临大变革。

疫苗——预防、控制和消灭病毒病的武器(上)

一种传染病,有一种病原体,就可发展一种疫苗,疫苗曾被简单地定义为:针对疾病产生免疫力的灭活的或减毒的病原体,即疫苗是由病原体制成的。随着医学科学的发展,出现了亚单位疫苗、毒力基因缺失疫苗、病毒载体活疫苗及核酸疫苗等,疫苗已不是完整的病原体,灭活和减毒的概念亦模糊不清了。疫苗的现代定义是:疫苗是致病原的蛋白(多肽、肽)、多糖或核酸,以单一成分或含有效成分的复杂颗粒形式,或通过活的减毒致病原或载体,进入机体后能产生灭活、破坏或抑制致病原的特异性免疫应答。病毒疫苗的防病作用疫苗在病毒性疾病的预防中发挥了重要作用,特别是对于人是传染源又无动物宿主的一些传染病,例如天花、脊髓灰质炎和麻疹等,其防病灭病作用更为显著。建国前,天花流行猖獗,每年因患天花死亡的人数以万计。建国后遵循"预防为主"的卫生工作方针,大力推行普遍种痘运动,迅速控制了天花流行。