乙型脑炎病毒SA14-14-2株E蛋白主要抗原片段的高效表达

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14 14 2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,将其亚克隆入酵母表达载体pPICZαA,以电穿孔法转化酵母X 33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS PAGE和免疫印迹分析表达产物。由于糖基化不同,所表达产物有两种,其相对分子质量分别为44kDa和50kDa,表达量较高,约为290mg/L,经Western印迹验证,有较好的抗原性。在ELISA试验中,我们直接以PBS透析后的酵母上清包被,能够很明显地区分出乙脑阴阳性血清,与RT PCR检测的相符率达95%,为制备JEV的诊断抗原和基因工程疫苗提供了依据。

乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70在毕赤酵母中的融合表达

目的构建乙脑E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosisheat shock protein70,Mt.hsp70)基因融合表达载体,并研究其在巴斯德毕赤酵母中的表达情况,为改善发展新的乙脑疫苗打基础。方法以酵母表达载体pPICZα-A为基本单位构建E蛋白基因主要抗原片段与hsp70的融合表达载体,融合基因以酶切位点BamHⅠ连接,用电穿孔法转化酵母X-33,用Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。结果E蛋白基因与hsp70的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为114kD,与实际大小相符,经凝胶薄层扫描分析,表达量为33mg/L,经Western印迹验证,有良好的抗原性。结论E-hsp70融合蛋白在酵母中的表达为下一步研究hsp70是否能作为E蛋白免疫时的理想佐剂作准备。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原表位的原核表达

为了克隆乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因的原核表达系统，试验采用RT—PCR方法扩增乙型脑炎病毒E蛋白上2个重要抗原域73～88aa和292～402aa，并将其定向连接至原核表达载体pET-32a（＋），构建重组质粒pET—EAB，再将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞，用IPTG进行诱导表达，应用SDS—PAGE和Western—blot技术对表达产物进行检测与鉴定。结果表明：经SDS—PAGE分析，表达出的目的蛋白主要以包涵体形式存在；再使用Western—blot技术对纯化复性后的包涵体进行检测，证实其具有免疫活性。

乙型脑炎病毒E蛋白Ⅰ、Ⅱ结构域抗原表位鉴定

为鉴定乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白I,II结构域抗原表位,本研究设计了一系列针对E蛋白的I、II结构域(1aa～296aa)部分重叠短肽,分别进行GST融合表达,用JEV阳性血清进行western blot和ELISA反应性筛选,获得了5个线性抗原表位分别为:E1(1FNCLGMGNRDFIEGAS16)、E10-4(77TGEAHNEK84)、E11-2(83EKRADSS YVCKQ94)、E19(145GTTTSENHGNYSAQVG160)和E33(257SQEGGLHHALAGAIVV272)。除E10和E19外,其它表位均为第一次通过实验方法确定的。将这5个融合蛋白对小鼠进行免疫,获得了高滴度的针对5个融合短肽的抗血清,研究证明了这些表位具有良好的免疫原性。本研究为乙型脑炎特异性诊断试剂及表位疫苗的开发奠定了基础。

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经westernblot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156。该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEVE19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应。本实验结果表明JEVE蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义。本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础。

乙型脑炎病毒E蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达

利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析

乙型脑炎病毒E基因Ⅰ、Ⅱ抗原域片段的克隆与原核表达

根据Genebank公布的乙型脑炎病毒E蛋白基因的序列设计并合成一对特异性引物,以pMD18-T-JEV-E质粒为模板,通过PCR扩增E蛋白抗原Ⅰ、Ⅱ基因片段,所得基因纯化后与PGEX-4T-1同时双酶切并重组构建PGEX-JEV-E12质粒,经过测序确定插入编码框正确后经异丙基巯基半乳糖(IPTG)诱导,观察不同诱导时间、不同IPTG浓度对表达的影响,优化反应条件,对表达产物进行SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹进行分析.结果通过测序证明重组质粒正确插入读码框成功,转化至感受态细胞中以包涵体形式表达,37℃时最佳诱导条件的反应条件为IPTG浓度0.6mmol/L,诱导时间为8 h;蛋白免疫印迹显示,重组表达蛋白和单抗、多抗均能进行中和反应,无非特异性表达.表明表达蛋白具有良好的抗原性,为进一步进行分析E蛋白基因结构与功能的关系、研制新型ELISA诊断试剂和开发基因工程疫苗奠定了基础.

乙脑E蛋白主要抗原片段与hsp70肽连接区融合酵母表达载体的构建

构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis hear shock protein70,Mt．hsp70)的肽连接区(Binding domain)基因融合表达载体,利用酵母表达系 统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。以酵 母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵 母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。E蛋 白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为 68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。将 用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段(另文发表)与上述融合蛋白均以50pmol． 的量分别对6-8周龄的:BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增 殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗 原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。

乙脑E蛋白与结核杆菌HSP70的融合蛋白对BALB/c小鼠特异性免疫的影响

研究酵母表达的乙脑病毒(JapaneseEncephalitisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70 (hsp70 )形成的融合蛋白对小鼠细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹膜内注射蛋白的方法免疫小鼠,以直接免疫E蛋白主要抗原片段和以E蛋白主要抗原片段和单独表达的hsp70两者均以5 0pmol的量进行混合后的蛋白免疫的小鼠作为对照,用半定量RT PCR检测细胞免疫因子IL 2mRNA的水平,IL 2是细胞介导的免疫反应和巨噬细胞激活中的关键分子,MTT法检测淋巴细胞的增殖情况以及通过ELISA检测抗体水平,从这3个方面来评价融合与未融合蛋白以及等量混合后的免疫效果。结果E蛋白主要抗原片段与结核杆菌hsp70重组后,mIL 2 ,淋巴细胞的增殖以及抗体水平均较重组前明显升高,因此,以乙脑E

乙脑病毒E-Hsp70与E-肽连接区对小鼠特异性免疫的比较

在本实验室已构建的原核表达载体(含乙脑疫苗株SA14-14-2株E蛋白基因主要抗原片段)的基础上用巴斯德毕赤酵母系统表达,该片段长1113bp,编码371个氨基酸残基,研究酵母表达的该乙脑病毒(Japaneseencephali-tisvirus)E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Hsp70)的融合蛋白以及该抗原肽与Hsp70上的一个功能域-肽连接区(Peptidebindingdomain,以下简称BD)融合形成的蛋白,用这三种蛋白分别免疫BALB/c小鼠,以酵母单独表达的E蛋白主要抗原片段免疫作为对照,比较它们对小鼠抗E蛋白主要抗原片段特异性的细胞免疫和体液免疫的影响。采用腹腔内注射蛋白的方法免疫小鼠,主要从IL-2的mRNA水平,淋巴细胞的增殖和抗体滴度这三个方面进行比较,最后我们得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比E-Hsp70略好一些,所以在本试验中肽连接区是完全可以代替Hsp70独立行使其佐剂功能。

携带猪乙型脑炎DNA疫苗减毒沙门菌的构建及其免疫原性

将乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原片段基因串联,构建真核表达载体pCI-EAB。将重组质粒pCI-EAB转染Vero细胞,表达产物通过RT-PCR和间接免疫荧光试验可检测出目的基因的转录与表达。质粒pCI-EAB电转化入减毒猪霍乱沙门菌,观察重组菌的安全性、体内外的稳定性与免疫原性。动物试验表明,重组菌是相对安全和稳定的;重组菌S.C500/pCI-EAB体外培养时,D600值在0.8左右质粒是比较稳定的;以1×108CFU剂量的重组菌S.C500/pCI-EAB口服免疫小鼠,在二免后1周和三免后1周,重组菌抗体水平与S.C500/pCI-neo空载体组差异显著(P<0.01);脾脏淋巴细胞增殖情况显示,重组菌对ConA有显著的反应性,且与对照组差异明显,同时CD3+、CD4+和CD8+T细胞的数量也显著高于对照组(P<0.01)。上述结果初步表明,以减毒沙门菌为载体的猪乙型脑炎DNA疫苗具有良好的安全性、稳定性和免疫原性,为猪乙型脑炎口服活菌疫苗的研制奠定了基础。