玉米乙烯应答元件结合蛋白基因启动子克隆与功能验证

为了给玉米转基因研究提供更多的非生物逆境诱导启动子,寻找只在逆境胁迫条件下适当驱动外源抗逆基因的表达,在生物信息学分析的基础上,克隆与水稻DREB1B转录因子基因同源的玉米乙烯应答元件结合蛋白基因sb CBF6的启动子psb CBF6,在非生物逆境应答元件分析和实时定量PCR验证其非生物逆境胁迫响应特性后,用以构建驱动报告基因GUS的表达载体,并使用基因枪法转化玉米愈伤组织,通过愈伤组织的GUS荧光值与荧光素酶发光值的比值,评价psb CBF6启动子在非生物逆境胁迫及激素诱导条件下的驱动活性。结果表明,sb CBF6基因在各种非生物逆境胁迫下差异表达。psb CBF6启动子长1 479 bp,存在多种与非生物逆境胁迫应答相关的调控元件,可在非生物胁迫条件下驱动外源抗逆基因在转基因植物中诱导表达。试验结果为研究抗逆转基因玉米提了供参考。

微小RNA-134靶向调控环腺苷酸应答元件结合蛋白/脑源性神经营养因子通路对脑卒中后抑郁海马神经细胞的影响

目的探讨微小RNA-134(miR-134)对脑卒中后抑郁海马神经细胞的影响及相关作用机制。方法建立脑卒中后抑郁大鼠模型,分离海马组织及海马神经细胞,并将体外培养的海马神经细胞分为对照组、miRNA NC组(转染miRNA NC)和miR-134 siRNA组(转染miR-134 siRNA)。实时荧光定量PCR法检测海马组织及海马神经细胞miR-134及环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)1、脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达水平,Western blotting法检测海马组织及海马神经细胞p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白表达情况,CCK-8法检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-134与CREB1的靶向作用关系。结果与正常组相比,造模组大鼠海马组织中miR-134表达水平显著升高,CREB1、BDNF mRNA水平及p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白水平显著降低(均P<0.05)。与对照组、miRNA NC组相比,miR-134 siRNA组海马神经细胞中CREB1、BDNF mRNA水平,p-CREB1/CREB1、BDNF蛋白水平及细胞吸光度(OD)值显著升高,细胞凋亡率显著降低(均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在海马神经细胞中,miR-134可靶向CREB1表达。结论miR-134可能通过靶向抑制CREB表达,进而下调BDNF表达,抑制脑卒中后抑郁海马神经细胞增殖并促进其凋亡。

环磷酸腺苷应答元件结合蛋白调控的转录共激活因子在肿瘤发生发展中作用的研究进展

环磷酸腺苷应答元件结合蛋白(cyclic adenosine monophosphate response element binding protein,CREB)调控的转录共激活因子(CREB-regulated transcription coactivators,CRTCs)是一个新发现的细胞内信号整合子家族,能极大地增强CREB的活性,而CREB作为细胞内的重要转录因子,参与调节细胞众多的生理活动。越来越多的研究表明,CRTCs参与调控细胞的生长、分化、增殖、存活、DNA损伤修复和凋亡相关的信号通路,在肿瘤的发生发展中起着重要作用。本文概要介绍CRTCs在肿瘤领域的研究进展。

ERFs转录因子及其在植物胁迫应答中的作用

ERFs(ethylene-responsive factors)是植物特有的一类转录因子,位于乙烯信号转导途径的下游,具有一个高度保守的含58或59个氨基酸的DNA结合域,通过结合相关基因的启动子顺式作用元件调控植物生物和非生物胁迫反应。综述ERF转录因子的结构特征和分类及其在植物抗逆作用中的研究进展。

ERF转录因子对生物胁迫的反应及对棉花抗性改良的意义

大量研究表明植物中ERF(ethylene responsive factor)类转录因子广泛参与外界环境胁迫应答基因表达的调控。它编码的蛋白能够特异结合GCC-box元件,从而调控启动子含有GCC-box的病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病反应中发挥重要的调控作用。棉花中ERF基因表达受生物和非生物胁迫诱导,并在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用。一些ERF基因在转基因植物中的超表达表现出了一定的广谱抗性,因而在棉花分子育种中具有较为广阔的应用前景。本文主要论述了棉花等植物中ERF的结构与功能特征,当前相关研究进展,及其对棉花抗病性分子遗传改良的意义。

番茄2个ERF-B1亚族转录因子基因的克隆及其对生物和非生物胁迫响应

为进一步研究番茄ERF转录因子调控植物抗逆的分子机理,本研究以番茄浙杂-301为试验材料,分别克隆获得2个乙烯反应元件结合蛋白基因SlERF83和SlERF109,并对其进行序列及表达分析。结果表明,番茄SlERF83和SlERF109基因分别含有678 bp和669 bp的开放阅读框,编码225和222个氨基酸,各含有1个保守的AP2结构域,属于亲水性蛋白。进化分析表明,这2个ERF转录因子均属于AP2/ERF家族中ERF亚族的B1组。SlERF83和SlERF109三级结构都含有1个α-螺旋和3个β-折叠。酵母单杂交及β-半乳糖苷酶活性测定结果证明SlERF83转录因子可以与GCC-box结合。番茄2个ERF蛋白启动子含有多种逆境相关的顺式作用元件。采用荧光定量PCR检测SlERF83和SlERF109在非生物和生物胁迫下的表达,结果表明,高盐和干旱胁迫下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制;水杨酸处理能够诱导SlERF83和SlERF109基因的表达;茉莉酸甲酯处理下SlERF83表达水平提高,SlERF109表达量降低;番茄黄化曲叶病毒侵染下,SlERF83和SlERF109基因的表达均被抑制。SlERF83和SlERF109转录因子可能参与了番茄对生物及非生物胁迫的响应过程。本研究结果为进一步深入开展ERF转录因子调控番茄抗逆分子机制研究提供了一定的理论依据。

乙烯信号转导新调控因子MHZ3的作用机制

乙烯在植物生长发育过程中以及环境应答反应中起着重要的调控作用.研究人员通过解析水稻乙烯不敏感突变体MHZ3,鉴定膜蛋白MHZ3及通过影响EIN2的N端跨膜区促进乙烯信号转导的作用机制.MHZ3编码一个内质网膜蛋白,其表达在转录和蛋白水平均受到乙烯诱导.

丹参功能基因组学研究Ⅳ——丹参乙烯应答因子(ERF)基因的分析

目的:获得丹参乙烯应答因子结合蛋白基因序列,并进行生物信息学分析和初步的表达特性研究。方法:利用cDNA芯片技术,从不同时期毛状根中获得目的基因。利用BLAST进行序列比对,ORF finder寻找开放读码框,Prosite分析蛋白质的基本结构域。用半定量RT-PCR检测其在丹参组培苗根、茎、叶中的表达情况。结果:得到1个乙烯应答因子结合蛋白基因全长序列,全长952bp,具有1个699bp的开放读码框和87bp的5′非编码区、166bp的3′非编码区,推测的氨基酸序列中含有1个高度保守的AP2/ERFDNA结合域,GenBank EF667000,命名为SmERF。半定量RT-PCR表明,SmERF基因在丹参组培苗根、茎、叶中均有转录水平的表达,根中表达量高于茎和叶中的。结论:首次得到丹参乙烯应答因子结合蛋白基因,为其功能研究提供了基础。

番石榴叶总黄酮对2型糖尿病模型小鼠肝糖异生ERRγ/CREBH信号通路相关因子的影响

目的:探讨番石榴叶总黄酮(GLTF)对2型糖尿病(T2DM)模型小鼠肝脏雌激素相关受体γ(ERRγ)/环磷酸腺苷应答元件结合蛋白H(CREBH)通路相关因子的影响,探讨其降血糖作用的具体机制。方法:取健康雄性ICR小鼠,采用高糖高脂饲料喂养联合多次腹腔注射小剂量链脲佐菌素的方法建立T2DM模型。将造模成功的小鼠按血糖值随机分为模型组、二甲双胍组(阳性对照,0.17 g/kg)、消渴降糖胶囊组(阳性对照,0.75 g/kg)和GLTF低、高剂量组(0.047、0.094 g/kg),每组12只;另选12只正常小鼠作为正常组。除正常组和模型组小鼠灌胃等体积水外,其余各组小鼠灌胃相应药物溶液10 mL/kg,qd,连续21 d。给药结束后,检测各组小鼠空腹血糖值、血清胰岛素水平,计算胰岛素敏感指数(ISI);采用苏木素-伊红染色法观察小鼠肝脏和胰腺组织病理学变化;采用免疫印迹法检测小鼠肝组织中ERRγ、CREBH的蛋白表达水平;采用实时定量聚合酶链式反应法检测小鼠肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1α(PGC1α)、CREB调节转录辅激活因子2(TORC2)的mRNA表达水平。结果:与正常组比较,模型组小鼠空腹血糖和血清胰岛素水平均显著升高,ISI值显著降低(P<0.01);肝组织病变明显、可见大量空泡;胰腺组织中胰岛数目减少、体积变小,胰岛细胞呈轻度空泡病变;肝组织中ERRγ、CREBH的蛋白表达水平及PGC1α、TORC2的mRNA表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,GLTF各剂量组小鼠上述血糖、胰岛素指标及病理学变化均明显改善;肝组织中ERRγ、CREBH的蛋白表达水平及PGC1α、TORC2的m RNA表达水平均显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:GLTF对T2DM模型小鼠具有明显降糖及肝、胰腺组织保护作用;其降血糖作用的机制可能与抑制肝脏ERRγ/CREBH信号通路有关。

高住低练对大鼠骨骼肌丙酮酸激酶及其转录调节因子的影响

目的:探讨HiLo训练对大鼠骨骼肌PK及其转录调节因子HIF-1α和ChREBP的影响。方法:40只适应训练后8w龄SD大鼠随机分为低住安静组(LC)、低住低练组(LoLo)、高住安静组(HC)、高住低练组(HiLo)。高住组每天低氧暴露12 h(氧浓度13.6%,相当于海拔3500 m),低练组进行35 m/min、1 h/d、5d/w跑台训练、共训练4w。比色法检测腓肠肌PK活性,RQ-PCR和WB检测PK、HIF-1α和ChREBP的基因和蛋白表达。结果:(1)低氧显著降低PK活性(P<0.01),运动显著升高PK蛋白表达(P<0.05),低氧和运动均能显著提高PK mRNA表达(P<0.01)且具有显著的交互作用(P<0.01);(2)低氧和运动均能显著提高HIF-1αmRNA和蛋白表达(P<0.01)且具有显著的交互作用(P<0.01);(3)运动对ChREBP mRNA和蛋白表达影响显著(P<0.05和P<0.01),且低氧和运动具有显著的交互作用(P<0.01)。结论:4周HiLo训练能够降低大鼠腓肠肌安静状态下PK活性,并通过上调其转录调节因子HIF-1α和ChREBP基因和蛋白的表达诱导PK基因表达,有利于PK在机体安静状态储备能量和在运动状态激发活性,是HiLo训练适应的结果。

枣ZjERF53转录因子的转录激活分析及互作蛋白筛选

乙烯应答因子广泛参与调控植物生长发育和非生物胁迫响应过程。本研究克隆了1个在枣(Ziziphus jujuba Mill.)果实成熟后期高表达的ZjERF53转录因子,对其进行了亚细胞定位、转录激活活性和互作蛋白筛选研究,以揭示其生物学功能。研究结果表明:ZjERF53基因编码区序列全长为1155 bp,能在细胞核和细胞膜中表达;ZjERF53具有自激活活性,其转录激活功能区域位于蛋白序列C端;以无自激活活性pGBKT7-ZjERF53-N为诱饵,通过酵母双杂交技术筛选枣果实cDNA文库,共获得4个互作蛋白。本研究揭示了ZjERF53可能参与枣树抗病和抗旱等非生物胁迫响应,为解析ERF参与调控枣树生物学过程的分子机制提供了工作基础。

甜瓜乙烯应答因子基因CmERF Ⅰ-14的生物信息学分析

本研究采用生物信息学的方法对甜瓜数据库中的甜瓜乙烯应答因子基因ERFⅠ-14(登录号:MEL O3C014441)的启动子特性、RNA结构、理化性质、导肽、信号肽、跨膜结构域、蛋白质二级结构、三级结构及功能域等进行预测和推断。结果表明,CmERFⅠ-14基因的开放阅读框(ORF)长645 bp,编码214个氨基酸,蛋白质的分子量约为23 kD,理论等电点为6.59,不存在导肽和信号肽,无跨膜结构域,二级结构中最主要的结构元件是无规则卷曲,包含一个AP2/ERF功能结构域,预测到8个可能的互作蛋白和多个启动子元件,没有预测到CpG岛。系统发育分析发现,其与黄瓜ERF3-like蛋白(XP_004140127.1)亲缘关系最近。

植物内质网胁迫应答研究进展

内质网是所有分泌蛋白和大部分膜蛋白合成和折叠的场所。当植物处于逆境时,错误折叠和未折叠蛋白会大量积累在内质网,导致内质网胁迫,为了缓解胁迫,细胞会启动保守的未折叠蛋白应答途径去帮助蛋白折叠,或将错误折叠蛋白降解。内质网胁迫应答在植物发育、抗逆、抗病等过程中发挥了重要的作用。总结了近年来内质网胁迫在植物中的相关报道,对膜结合转录因子和内质网胁迫之间的关系进行了阐述,并提出在研究内质网胁迫途径中未解决的问题,以期为进一步理解内质网胁迫和抗逆的关系提供一些参考。

细胞动粒蛋白Hec1启动子的结构及功能分析

细胞的分裂是一个严格调控,高度有序的过程.为了将复制后的染色体均匀、准确地传递给两个子细胞,细胞在分裂中后期受到纺锤体检验点的严格监控.Hec1定位于动粒,是纺锤体检验点调控的关键蛋白之一,它通过螺旋-螺旋结构域与其他动粒蛋白相互作用调节姐妹染色体的精确分离.为研究Hec1转录水平的调控机理,采用BLAST工具,从GenBank中搜索到了人Hec1基因上游的序列,并利用在线工具http://mbs.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html提供的转录因子结合位点搜索引擎,对其5′启动子调节区段进行了分析.分析结果表明:在Hec1基因上游-200～-1序列内,存在E2F、ATF4和cAMP应答元件结合蛋白(CREB)等转录因子调控元件.在结构分析的基础上,提取HeLa细胞基因组DNA,用PCR方法克隆了Hec1基因启动子,并构建了多个含启动子不同区段的pGL3荧光素酶报告基因表达质粒.瞬时转染HeLa细胞后的结果表明,-70～-63以及-155～-144之间的启动子区对维持荧光素酶活性最为关键.凝胶迁移实验证明,这两个区段分别能够和转录因子CREB以及ATF4结合.随后,采用野生型的以及含有133位磷酸化位点突变的CREB转染HeLa细胞,通过荧光定量PCR实验发现,Hec1的表达水平分别出现明显上升和下降.该结果表明,Hec1表达的调控是通过CREB的活化来完成的.

核转录因子NF-kB与危重症的关系

NF—kB最初是由Sen和Baltimore等于1986年在B淋巴细胞提取物中检测到的一种核蛋白．它能与免疫球蛋白K轻链基因的增强kB序列（5’-GGGACTTTCC-3’）特异结合，并能促进K链基因表达，故命名为核转录因子kB。进一步研究表明，NF—kB是一种重要的核转录因子．由一个复杂的体系组成．它不仅存在于B细胞中。而且也存在于T细胞、胸腺细胞、树突状细胞、巨噬细胞等多种细胞中。可与多种细胞因子、粘附分子等基因启动子或增强子kB位点特异结合，启动和调节这些基因的转录，在机体免疫应答、炎性反应和细胞生长、发育、调控等方面发挥重要作用。近年来，研究发现NF—kB在危重症的发生、发展过程中起着重要作用，成为危重症治疗的新靶点。

酵母单杂交系统分离胡萝卜生长素应答元件结合因子

高等植物胚根发育过程中,生长素是植物细胞进行分裂、延伸和分化的信号,对根的形成等起着不可缺少的促进作用.生长素应答元件（AuxRE）存在于很多生长素诱导基因的启动子中,并具有对生长素作用的应答活性.本研究构建了特定发育时期的胡萝卜体细胞胚cDNA-AD融合表达文库,同时构建了含有生长素应答元件的重组报告质粒.以生长素应答元件为诱饵,通过酵母单杂交系统筛选获得1个阳性克隆,该阳性克隆在酵母中表达的AxRF1蛋白能够在体外结合实验中与生长素应答元件结合,对AxRF1是否有可能参与胡萝卜体细胞胚中生长素诱导基因的表达调控进行了讨论.

乙烯应答因子W17基因RNAi表达载体的构建及小麦遗传转化

干旱、高盐和病虫害严重影响了作物的产量和品质。ERF(ethylene responsive factor)转录因子是介导生物和非生物胁迫响应的重要调控因子。本实验室从小麦中克隆到抗逆相关ERF转录因子W17基因,本研究以植物表达载体pAHC25为基础,构建了含有反向重复序列的RNAi表达载体pAHC-W17RNAi。采用基因枪法45枪轰击小麦品种新春9号幼胚材料2 379个,共获得115株T0代再生植株,其中12株为阳性转基因植株。半定量RT-PCR分析表明,转基因植株中W17基因及其调控的下游基因的表达水平均显著下降;表型鉴定发现转基因小麦苗期发育受到抑制。本研究为深入分析小麦ERF基因的功能与作用机制,进而通过分子育种进行小麦抗性改良奠定了基础。

七氟醚-N2O麻醉对青年小鼠空间学习和记忆功能及pCREB和Egr1表达的影响

目的研究七氟醚-N2O麻醉后青年小鼠的空间学习和记忆能力以及海马磷酸化环腺苷酸应答元件结合蛋白(phosphorylated cyclic AMP response element-binding protein,pCREB)和早期生长反应因子1(early growth response factor 1,Egr1)的表达,并与老年小鼠进行比较。方法12只3月龄和12只18月龄小鼠随机分为对照组和实验组,每组各6只。48 h后进行为期6天的获得训练。获得训练结束后24 h进行空间探索实验,实验结束后15 min收集两组小鼠的海马组织,通过Western blot和实时定量PCR方法评估pCREB和Egr1的表达水平。结果未见麻醉损害青年小鼠的空间学习和记忆功能以及海马中pCREB和Egr1的表达水平,麻醉组与对照组比较差异均无统计学意义;而老年小鼠Sev+N2O组在麻醉后第4、5、6天逃逸潜伏期显著长于对照组(P<0.05),两组小鼠游泳速度差异无统计学意义;在空间探索实验中,Sev+N2O组目标象限路程百分比和时间百分比显著低于对照组(P<0.01);海马中pCREB和Egr1的表达水平均较对照组显著下降(P<0.05)。结论七氟醚-N2O麻醉对青年小鼠的空间学习记忆能力没有损害,也不影响海马中pCREB和Egr1的表达,但会对老年小鼠造成损害。

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。