基因芯片技术在乙肝病毒基因型及YMDD变异检测中的应用

目的评价基因芯片技术在HBV基因型及HBVP基因YMDD变异检测中的应用价值,并对不同基因型病例的临床情况进行分析。方法抽提HBV DNA,用PCR方法扩增S基因及P基因部分区域,扩增产物与基因芯片上的寡核苷酸探针进行杂交,杂交结果通过芯片影像读取仪扫描到计算机上,经软件分析可得到HBV基因型、HBVYMDD野生型及YVDD、YIDD变异型结果;部分标本通过HBV preS/S基因序列测序证实。结果38份高病毒滴度标本(HBV DNA定量>1.0×105拷贝/毫升)中22例为B基因型(58%),16例为C基因型(42%);32例为HBV YMDD野生型,2例为YVDD变异型、4例为YIDD变异型。临床情况方面,无症状携带者中有2例为基因型B、3例为基因型C,慢乙肝患者中有16例为基因型B1、2例为基因型C,肝硬化患者中有4例为基因型B、1例为基因型C;B型和C型患者e抗原阳性率分别为54.5%(12/22)和87.5%(14/16)。10份HBV DNA定量<1.0×105拷贝/毫升的标本不能检测出HBV基因型及YMDD变异情况。11例阳性标本的基因测序结果与基因芯片检测结果一致。结论(1)基因芯片检测HBV基因型及HBV P基因区YMDD变异准确性高、特异性好,同时每次实验得到的信息量多,适合于临床开展应用,但需提高灵敏度;(2)C基因型乙肝患者HBV e抗原阳性率高于B型患者。

乙肝病毒P基因区YMDD变异的临床检测技术进展

核苷类药物治疗乙型肝炎疗效确切，长期使用常导致病毒发生耐药性突变，其耐药的产生主要集中于HBVP基因的YMDD基序，耐药株的出现不仅会影响药物效果，引起病毒反跳，还易诱发机体新的免疫攻击，甚至导致严重后果。其临床检测具有重大的指导治疗和预测疾病预后的临床价值，因此，对YMDD变异的检测成为当今研究的热点之一。为此，我们对目前临床上常用的或具有很好临床应用前景的YMDD变异的检测技术及主要进展作一综述。

影响拉米夫定相关乙肝病毒YMDD变异的因素

拉米夫定是抗乙肝病毒的主要药物之一,因其抗病毒作用确切而被广泛用于治疗慢性乙型肝炎.随着拉米夫定的广泛应用,由拉米夫定导致的耐药问题逐渐成为人们关注的焦点.诱发乙肝病毒YMDD变异是引起拉米夫定耐药的主要机制.当YMDD变异病毒株成为优势株时就会影响拉米夫定的抗病毒疗效,出现耐药,导致病毒重新活跃,甚至病情的加重或死亡.目前研究认为影响拉米夫定相关YMDD变异的因素有:(1)拉米夫定用药时间.用药时间越长,发生YMDD变异的几率越大;(2)用药前病毒荷量、ALT水平及HBeAg状态.基线HBVDNA滴度高、ALT水平低或HBeAg阳性者较易发生YMDD变异;(3)前C区变异;(4)乙肝病毒基因型;(5)联合用药.

HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者乙肝病毒基因变异和分型研究

目的探讨HBeAg阴性的慢性乙肝患者乙肝病毒基因变异情况和分型的关系及其临床意义。方法采用荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBV-DNA)、实时荧光PCR检测乙肝病毒基因分型、PCR-反向点杂交方法检测乙肝病毒基因变异,并对其关系进行分析。结果在389例HBeAg阴性的慢性乙肝患者血清中HBV-DNA检出阳性214例(55.01%),阴性175例(44.99%),HBV-DNA拷贝数在1×103-水平的例数最高,为102例(26.22%),其次为1×104-水平,41例(10.54%),两者比较有性差异(P<0.001);基因变异方面,HBV-DNA载量在1×105-水平发生前-C区变异比例为71.43%(15例),发生BCP区变异比例为52.38%(11例),两者比较有性差异(P<0.001),并且HBV-DNA载量越高基因变异发生比例越大;214例HBeAg阴性HBV-DNA阳性的慢性乙肝患者基因分型与基因变异结果中,基因分型A型6例(2.80%),B型84例(39.25%),C型106例(49.53),D型7例(3.27),混合型11例(5.14%),两者比较有性差异(P<0.001);而发生前-C区变异结果中A型发生比例为16.67%(1例),B型发生比例为36.90%(31例),C型发生比例为44.34%(47例);在BCP区变异结果中B型发生比例为19.05%(16例),C型发生比例为26.42%(28例),两者比较有性差异(P<0.001),A、D型与混合型均未检出变异。结论 HBeAg阴性HBV-DNA阳性的慢性乙肝患者病毒复制水平处于一个相对较低水平;HBV-DNA载量越高基因变异发生比例越大;本地区乙肝病毒基因分布以B、C型为主,其中B、C基因型HBeAg阴性的慢性乙肝患者基因变异发生率较高。

拉米呋啶治疗后乙肝病毒聚合酶YMDD的变异

目的观察拉米呋啶治疗慢性乙肝患者1年前后,患者体内HBV DNA多聚酶结构域C的酪氨酸—甲硫氨酸—天门冬氨酸—天门冬氨酸(YMDD)基因变异情况,及其与血清HBV DNA、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平及乙肝标志物变化的关系。方法采用实时荧光定量PCR、ELISA及速率法分别检测60例乙肝患者经拉米呋啶治疗后其血清YMDD、HBV DNA、乙肝标志物及ALT的变化情况。结果拉米呋啶治疗9月、1年后YMDD的变异率分别为5%、13.3%。YMDD变异组HBV DNA阴转率为12.5%,无变异组HBV DNA阴转率为67.3%,两组阴转率相比差异有统计学意义(P<0.01)。拉米呋啶治疗1年后YMDD变异组ALT为(40.7±14.7)u/L,无变异组ALT为(26.5±10.1)u/L,两组相比差异有统计学意义(P<0.01)。5名HbeAg阴转患者无YMDD变异。结论乙肝患者经拉米呋啶治疗后,YMDD变异率随用药时间的延长可逐渐增加,当其HBV DNA、ALT含量出现明显反跳时,应及早改变治疗方案。

犬乙肝病毒S基因遗传变异研究

应用人乙肝诊断试剂盒 ,对检测出来的“三阳 (HBsAg、HBeAg、抗_HBc)犬的乙肝病料进行了病毒分离和形态学鉴定 ,并以人乙肝病毒S基因两侧的保守区域作为模板 ,采用PCR方法扩增出犬乙肝病毒部分基因。序列分析结果 ,其核苷酸序列为 1 1 5 7bp、编码 3 85个氨基酸。遗传变异分析结果表明 ,在S基因保守区内有 2 7个编码氨基酸与人的不同 ,其中 1 6个为性质相反或不同的氨基酸置换 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为 96.5 %和 93 .4% ,系统发育进化树比较表明二者的遗传关系较远 ,揭示犬乙肝病毒与人乙型肝炎病毒S基因保守区之间存在很大差异 ;而与鸡、羊乙肝病毒S基因保守区序列相比较 ,遗传变异更大。

江苏省泰州地区乙肝病毒基因型与基因变异的研究

目的 研究江苏省泰州地区乙肝病毒 (HBV)基因型分布和基因变异情况及其临床意义。方法 选择江苏省泰州地区HBV感染者 15 8例 ,其中乙肝携带者 2 9例 ,急性肝炎 (AC) 18例 ,慢性轻、中度肝炎 (CH) 5 6例 ,重型肝炎 (FHF) 2 2例 ,肝硬化 (LH) 2 1例 ,肝细胞癌 (HCC) 12例 ,采用基因芯片法进行基因分型和基因变异检测。结果 15 8例乙肝患者中B型 3 5例( 2 1 1% ) ,C型 12 1例 ( 76 6% ) ,B/C混合型 2例 ( 1 3 % )。 15 8例乙肝感染者中发生前C区基因 1896变异的 95例( 60 1% ) ,发生C基因启动子 (BCP) 1762变异的 93例 ( 5 8 9% ) ,发生HBV聚合酶 (P)基因区YMDD变异的 11例 ( 7 0 % )。结论 江苏省泰州地区存在乙肝病毒基因型B和基因型C ,其中C型占优势 ;乙肝患者基因组可有多种变异 ,BCP 1762变异、前C区 1896变异与肝病的严重程度有关 ;部分乙肝患者在拉米夫定治疗过程中产生耐药 ,可能和HBV(P)

IL-12和IL-4水平对观察和预测拉米夫定治疗乙肝病毒感染中发生YMDD变异的意义

目的:探讨在拉米夫定治疗乙型肝炎病毒感染中发生YMDD变异与治疗期间血清IL-12和IL-4水平变化的关系.方法:慢性乙型病毒性肝炎患者给予口服拉米夫定治疗1a时发生YMDD变异和未发生YMDD变异各选择40例,测定拉米夫定治疗后3、6、12mo血清IL-12、IL-4水平、乙肝两对半、肝功能和HBVDNA.结果:在无YMDD变异组患者中,血清IL-12和IL-4水平在治疗后各个时间点较治疗前均有统计学差异(IL-12治疗后3,6,12movs治疗前,t=2.691,2.351,2.158,P=0.02,0.03,0.04;IL-4治疗后3,6,12movs治疗前,t=2.653,2.107,2.234,P=0.02,0.04,0.03),表现为IL-12水平升高,IL-4水平降低;在YMDD变异组患者中,血清IL-12和IL-4水平仅治疗后3mo和治疗前相比有统计学差异(t=2.104,2.142,P=0.04,0.04),表现为IL-12水平升高,IL-4水平降低.YMDD变异组治疗后3mo和无变异组治疗后同一时间相比,其变化幅度小,且有统计学差并(IL-12:t=2.029,P=0.04;IL-4:t=2.028,P=0.04).结论:发生YMDD变异与治疗期间血清IL-12和IL-4水平变化有关,治疗期间其水平变化小而短暂者有更大的机会发生YMDD变异,动态检测血清IL-12和IL-4水平可以作为拉米夫定治疗乙型肝炎病毒发生YMDD变异的预测指标之一.

乙肝病毒基因变异与抗病毒治疗预后的临床分析

目的了解乙肝病毒基因变异与抗病毒治疗预后的临床转归的因果关系。方法对108例HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者测定基因分型,基因测序前C区、CP区变异;在治疗前、治疗后1个月、3个月,以后每三个月,检测HBV DNA载量,治疗中根据HBV DNA定量变化检测YMDD变异、阿德福韦耐药。部分患者治疗前、治疗后半年或1年肝穿病理检查;对治疗6年后的临床转归进行分析。结果 108例患者前C1896位(A83)的变异及CP区变异79.45%,无CP及前C变异20.55%;六年应用核苷类似物抗病毒治疗出现耐药58例,耐药率53.7%;转为肝硬化13例,转为肝癌3例,死亡1例,病情加重达15%。结论 HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者在抗病毒状态下,病变仍活动,肝硬化及肝癌的发生率较高,长期抗病毒治疗的结果 HBeAg阴性发生耐药率较高。需不断开发新的药物,并设计联合或序贯治疗。

乙肝病毒C区基因变异对干扰素疗效的影响

目的 :探讨乙肝病毒 (HBV) C区基因变异与干扰素疗效的相互关系。方法 :采用荧光定量 PCR法对 30例经干扰素治疗的慢性乙肝患者治疗前后病毒滴度进行检测。选取有反应、复发、无反应的患者各 3例 ,进行基因序列分析。结果 :干扰素治疗的总有反应率为 2 6 .7% (8/ 30 ) ,C区的基因变异多发生于抗原表位附近 ,主要为点突变及缺失突变 ,多不引起氨基酸水平的改变。CTL 表位氨基酸相对保守 ,总变异率约为 9氨基酸 / 9人 ,而 Th表位氨基酸变异相对较多 ,总变异率为 5 5氨基酸 / 9人。结论 :干扰素治疗后 HBV C区核苷酸及编码的氨基酸突变率增加 ,且多集中于 C区抗原表位 ,CTL 表位变异可能与干扰素疗效有关。

乙肝病毒C基因亚型与病毒变异的相关研究

目的探讨乙肝病毒C基因亚型与病毒变异的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法,对155例慢性HBVC基因感染者,包括78例肝细胞癌(HCC)、36例肝硬化(LC)和41例慢性肝炎(CH)血清样本进行C基因亚型和病毒基本核心启动子(BCP)以及前C区(PC)变异检测。结果在HCC、LC和CH研究组中C1的分布均高于C2,同时C1亚型有较高的BCP变异,C2亚型有较高的PC变异(P<0.030)。结论慢性HBVC基因型患者HCC的高发生率和有较严重的肝脏损害可能与其中C1分布较多有关,因此HBVC基因型患者进行亚型鉴定能更好地评估HBV基因型系列对慢性HBV感染疾病进展和临床结局的影响。

实时荧光PCR检测乙肝病毒YMDD变异的临床应用

目的 :探讨实时荧光 PCR检测 HBV YMDD变异价值。方法 :比较实时荧光 PCR法与 PCR产物直接测序的结果 ,以评价该方法的准确性 ,同时测定 10 3例拉米夫定治疗不同时期的患者血清 ,分析各时期的变异率及临床资料。结果 :19例标本的实时荧光 PCR结果与 PCR产物测序结果完全一致。10 3例患者中 13例发生 YMDD变异 ,治疗 7个月～ 12个月 YMDD变异率为 15 .2 % (5 /33) ,治疗 1a以上 YMDD变异率为 33.3% (8/2 4 )。变异患者与非变异患者体内的病毒量差异无显著性 ;变异患者 AL T异常发生率高于非变异患者 ,但升高程度不如部分非变异患者 ;变异患者保护性抗体的出现率较低。结论 :实时荧光 PCR检测 YMDD变异是一种准确、灵敏、经济、简便。