乙肝病毒核心相关抗原检测试剂盒的研发及临床检测

目的:研发一种检测乙肝病毒核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)的定量检测试剂盒并评价其性能。方法:通过研究原材料抗体、优化制备工艺和调整反应体系建立HBcrAg化学发光免疫检测方法,组装成试剂盒后利用重组HBcrAg和临床血清进行检测性能评估,数据处理使用IBM SPSS Statistics 20软件。结果:该试剂盒标准曲线为y=143.37x+344.91,R^(2)=0.9998;检测灵敏度为1.43 pg/mL;健康人参考区间≤25.595 pg/mL;检测208例慢性乙型肝炎患者血清,所有(18/18)乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)DNA10^(8)~10^(4)IU/mL血清HBcrAg检出值都在这个临界值以上;92.31%(24/26)HBV DNA10^(3)~10^(2)IU/mL血清HBcrAg检出阳性;44.51%(73/164)HBV DNA低于检出限血清HBcrAg检出阳性。结论:本试剂盒能较好地检测慢性乙型肝炎患者血清中的HBcrAg水平,在辅助慢性乙型肝炎患者治疗效果监测和正确判断治疗终点方面具有重要应用价值。

不同乙肝病毒载量与乙肝血清标志物模式、Pre-S1抗原定性结果的相关性分析

目的 分析不同乙肝病毒载量与乙肝血清标志物模式和Pre-S1抗原定性结果之间的相关性。方法选择我院2020年3-12月申请血清乙肝DNA定量检测的患者作为研究对象,收集所有的乙肝DNA定量数据,同时用ELISA法检测其乙肝血清标志物和Pre-S1抗原,将结果按照最新的指南进行分类并分析其相关性。结果本次研究的159例样本中共统计到不同乙肝血清标志物免疫模式有11种;HBV-DNA阳性率为55.97%;Pre-S1阳性率为70.44%;将乙肝五项血清标志物HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb分别采用①、②、③和③表示。①③模式下,各载量组阳性率:高载量组(87.10%)>中载量组(20.83%)>低载量组(2.94%)>低于检测限组(0),差异具有统计学意义(P<0.05)。①④③模式下,各载量组阳性率:低载量组(88.24%)>中载量组(79.17%)>低于检测限组(40.00%)>高载量组(9.68%),差异具有统计学意义(P<0.05)。比较各载量组Pre-S1抗原阳性率,高载量组(100%)、中载量组(100%)>低载量组(97.06%)>低于检测限组(34.29%),差异具有统计学意义(P<0.05)。比较各载量组HBeAg阳性率,高载量组(90.32%)>中载量组(20.83%)>低载量组(2.94%)>低于检测限组(0),差异具有统计学意义(P<0.05)。比较各载量组HBcAb阳性率,中载量组(100%)、低载量组(100%)>低于检测限组(84.29%)>高载量组(96.77%),差异具有统计学意义(P<0.05)。HBV-DNA载量均值与HBeAg阳性率之间存在显著相关性(r=1.000,P=0.000),HBV-DNA载量均值与Pre-S1阳性率之间相关性不显著(r=0.211,P=0.789),HBV-DNA载量均值与HBcAb阳性率之间相关性不显著(r=0.316,P=0.684)。结论 不同乙肝病毒载量与乙肝血清标志物中的HbeAg阳性率存在显著相关性,而与Pre-S1抗原定性结果的相关性不显著;临床应多维度、多方法结合评估患者病情,达到有效治疗的目的。

乙肝病毒核心抗原单链抗体细胞内免疫抗乙肝病毒基因治疗研究

目的:研究乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)人源单链抗体(ScFv)细胞内免疫抗乙型肝炎病毒(HBV)基因治疗的作用。方法:用噬菌体表面展示技术筛选特异性的HBcAg人源可变区单链抗体,聚合酶链反应(PCR)法和基因重组技术体外扩增HBcAg单链抗体基因,并构建表达HBcAgScFv基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-HBcAg,转染PA317细胞,逆转录PCR(RT-PCR)方法验证细胞培养液上清分泌的假病毒颗粒中HBcAg ScFv的表达;将假病毒颗粒感染2.2.15细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清HBsAg和HBeAg,定量检测HBV DNA。结果:成功筛选出HBcAg ScFv,PCR扩增出750bp的全基因,构建HBcAg ScFv基因的逆转录病毒载体,转染PA317细胞,在上清中检测出含HBcAg ScFv假病毒颗粒的存在,上清感染2.2.15细胞后第3、5、7、14天,HBsAg、HBeAg逐渐下降,到14d时HBsAg已变为阴性,DNA定量检测无明显变化。结论:HBcAg ScFV能成功地在逆转录病毒载体中表达,并有抑制HBsAg、HBeAg表达的作用。

禽类血管活性肠肽与乙肝病毒核心抗原融合基因的构建

:在制备以禽类血管活性肠肽 (VIP)为基础的基因工程疫苗工作中 ,选择乙肝病毒核心抗原 (HBcAg)作为载体来提高鹅VIP的免疫原性 .首先将克隆于鹅VIPcDNA和HBc基因第 1至 435bp的序列片段先后插入到质粒pRSETA的BamHI\EcoRI和NheI\BamHI克隆位点之间 ,构建成VIP序列位于HBc序列之后的VIP融合基因的重组质粒pHBc -VIP .其次将HBc第 1至 2 2 5bp序列的扩增片段和HBc第 2 44bp之后包括VIP的序列经扩增、EcoRI酶切、连接、再扩增的片段先后插入到质粒pBSKS + / -的BamHI\PstI和PstI\HindIII克隆位点 ,构建成VIP插入到HBc基因中间 (HBcAg的第 75和 82位氨基酸之间 )融合基因的重组质粒pVIP HBc .

乙肝病毒前S1抗原及核心抗体IgM在临床诊断中的价值

目的探讨乙肝病毒前S1抗原(PreS1-Ag)、乙肝病毒核心抗体IgM(HBcAb-IgM)在临床诊断中应用价值。方法对1068例乙型肝炎血清标志物阳性者,用酶联免疫法检测PreS1-Ag、HBcAb-IgM和乙肝血清标志物5项,对检测结果进行统计学分析。结果在HBsAg/HBeAg/HBcAb阳性组,PreS1-Ag和HBcAb-IgM的阳性率分别为81.55%和29.13%,明显高于HBsAg/HBeAb/HBcAb阳性组,阳性率分别为56.39%和5.90%(P<0.01);PreS1-Ag和HBcAb-IgM的阳性率在HBeAg阳性组,阳性率分别为79.69%和26.95%,明显高于HBeAg阴性组(P<0.01)。结论 PreS1-Ag和HBcAb-IgM与HBeAg具有很好相关性,与HBV 5项血清标志物联用有良好的应用前景。

猫重组变应原Fel d 1与乙肝病毒核心抗原融合基因的原核表达

为将猫重组变应原Fel d 1蛋白展示在乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒的表面,本试验将编码Fel d 1蛋白的两个基因chain1和chain2拼接在一起形成重组Fel d 1(rFel d 1),然后插入到HBcAg的c/e1loop区,取代HBcAg c/e1loop区的D78与E83之间的氨基酸。经密码子优化后进行全基因合成,成功构建了pET28aHBcAg-rFel d 1原核表达载体,将其转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,进行原核诱导表达与Ni-NTA亲和层析纯化,并进行SDS-PAGE电泳、Western blotting和透射电镜检测。结果显示,本试验成功表达了HBcAg-r Fel d 1融合蛋白,并利用镍柱纯化得到了较纯的HBcAg-rFel d 1融合蛋白,进一步利用负染法透射电子显微镜检测到HBcAgrFel d 1融合蛋白呈现病毒样颗粒结构。HBcAg-rFel d 1融合蛋白能自发形成病毒样颗粒结构,为猫过敏症的预防与治疗性疫苗的开发奠定基础。

PDGF受体结合域与乙肝病毒核心抗原的融合表达

化学合成血小板源性生长因子受体结合域１３肽基因，并与乙肝病毒核心抗原基因５′端融合，序列分析表明化学合成的１３肽基因及融合后基因的阅读框架正确．将融合基因亚克隆于ｔａｃ启动子控制的ｐＥＴ３ａ表达质粒中并于大肠杆菌中表达．表达产物经ＥＬＩＳＡ、ＷｅｓｔｒｅｎＢｌｏｔ鉴定表明，融合蛋白已被表达，其单位分子量与推算值一致．电镜观察证明所表达的融合蛋白能形成颗粒．

血清乙肝病毒核心抗原与乙肝病毒其它标志的关系

目的在于了解乙肝病毒核心抗原（ＨＢｃＡｇ）与乙肝病毒（ＨＢＶ）传染复制标志物在血清中的关系。方法：用固相放射免疫法和斑点杂交法进行了３７４６名乙型肝炎患者血清中乙肝病毒感染十项标志物的检测。结果：ＨＢｃＡｇ与ＨＢｓＡｇ、抗ＨＢｅ、ＰＨＳＡ、ＤＮＡＰ、ＨＢＶ—ＤＮＡ基本一致，检出率分别是６７８１％，７２８２％，７６２５％，６８％，３８８７％，６２８１％，经卡方检验ｐ值＞００５，相差不显著；与抗ＨＢｓ，ＨＢｅＡｇ，抗ＡＢＣ—ＩｇＭ检出率分别是１６８８％，１５％，５％，Ｘ２检验相差非常显著ｐ＜００１。结论：ＨＢｃＡｇ也可作为一个反映ＨＢＶ的复制情况和传染性的指标。

肾小管乙肝病毒抗原沉积对乙肝相关性肾炎临床及病理影响分析

目的探讨肾小管有乙肝病毒抗原沉积对乙肝相关性肾炎(HBV-GN)患者的临床表现及病理特点的影响。方法回顾性分析2009年1月至2016年1月在我院经肾活检证实的乙型肝炎病毒相关肾炎患者69例的临床表现及病理特点。根据肾小管是否有乙肝病毒抗原沉积分为研究组和对照组,对比分析两组患者之间的临床及肾脏病理特点。结果在蛋白尿、肝功能、尿酸、血红蛋白、乙肝病毒血清标志物、病理类型分布等方面比较,两组差异无统计学意义(P>0.05),但研究组较对照组肾功能损害的发生率更高(P<0.05),研究组出现中重度肾小管间质病变的发生率(52.2%)高于对照组(17.4%)(P<0.05)。结论肾小管有乙肝病毒抗原沉积更容易发生肾小管间质病变及肾功能损害。

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)基因真核表达载体,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础。方法根据乙肝病毒核心抗原基因序列,设计合成3对引物,在引物中引入分别针对人、鼠敏感的CpG片段和不含CpG的片段,用PCR方法从慢性乙肝患者血清DNA中扩增出乙肝核心抗原基因片段,将扩增的产物与真核表达质粒pZeoSV2(+)连接,构建重组体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),进行酶切、PCR及测序鉴定。结果乙肝核心抗原基因体外扩增产物大小约为530bp。所构建的pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)重组体经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符;测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体构建正确。结论成功地构建了真核重组表达载体pZeoSV2(+)/CpG-HBcAg(ISS),为CpG的功能研究和乙肝治疗性疫苗的研制提供了物质基础。

插入CpG序列的乙肝病毒核心抗原基因真核表达质粒的构建及在树突状细胞中的表达

目的:构建pEGFP-N1/CpG-HBcAg(ISS)真核表达载体,探讨乙肝病毒核心抗原(HBcAg)在树突状细胞(DC)中的表达,为研制乙肝治疗性疫苗奠定基础。方法:根据HBcAg基因序列,设计合成两对引物,在引物中引入针对人敏感的CpG基序和不含CpG的片段,用PCR方法从慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增出HBcAg基因片段,将扩增产物与pEGFP-N1连接,构建重组体pEGFP-N1/CpG-HBcAg,进行酶切、PCR及测序鉴定;分离人外周血单个核细胞(PBMC),体外诱导分化为DC,通过脂质体将重组质粒pEGFP-N1/CpG-HBcAg和空载体分别转染DC,Western blot检测HBcAg在DC的表达。结果:HBcAg基因体外扩增产物大小为530bp。所构建的pEGFP-N1/CpG-HBcAg经双酶切及PCR鉴定,与预期片段的大小相符。测序结果与GenBank中收录的HBcAg全长序列一致,表明pEGFP-N1/CpG-HBcAg真核表达体构建正确;PBMC体外成功刺激分化为DC,HBcAg可在DC中表达。结论:成功构建了真核重组表达载体pEGFP-N1/CpG-HBcAg,且可在DC中表达,为CpG的功能研究和乙型肝炎治疗性疫苗的研制奠定基础。

血清乙肝病毒核心抗原检测的临床意义

乙肝病毒核心抗原(HBcAg)是乙型肝炎病毒(HBV)的核心成分,存在于Danes氏颗粒的核心和乙型肝炎患者的肝细胞核内,是HBV直接复制指标。若在血清中检出HBcAg则说明有HBV复制。检测血清HBcAg对于评价HBV感染者血清传染性,估计患者预后以及制订合理治疗方案、预防上有重要的临床意义,同时它与其他血清标志物具有明显的相关性。现将血清HBcAg检测的临床意义作综述。 1 HBcAg与血清HBV其它标志物的关系 血清HBcAg与其他HBV标志物有良好的相关性。HBcAg阳性的HBV感染中,

乙肝核心相关抗原联合AFP、PIVKA-Ⅱ对乙肝相关肝癌的诊断价值研究

目的探讨乙肝感染不同阶段的乙肝核心相关抗原(hepatitis B core-related antigen,HBcrAg)水平及HBcrAg联合AFP、异常凝血酶原(protein induced by vitamin K absence-Ⅱ,PIVKA-Ⅱ)对乙肝相关肝癌的诊断价值。方法选取2019年10月至2021年3月首都医科大学附属北京佑安医院的HBsAg阳性患者562例,根据临床诊断分为慢乙肝组(173例)、肝硬化组(218例)、肝癌组(54例)和肝癌术后组(117例);分别以HBsAg 3.0 Log IU/ml,HBcrAg 4.0 Log U/ml为界将所有患者分为4组,其中低HBsAg低HBcrAg组(142例)、低HBsAg高HBcrAg组(124例)、高HBsAg低HBcrAg组(31例)和高HBsAg高HBcrAg组(113例)。比较各组HBcrAg、AFP、PIVKA-Ⅱ等血清学标志物水平,采用ROC曲线评估HBcrAg、AFP和PIVKA-Ⅱ对乙肝相关肝癌的诊断价值。结果562例患者中,男403例,女159例;年龄7~81岁,中位年龄51.0岁。临床诊断各组HBcrAg、AFP、PIVKA-Ⅱ等指标的比较,差异均有统计学意义(P<0.05);低HBsAg高HBcrAg组肝癌患病比例为12.1%(15/124),高于其他组(P<0.05)。HBcrAg、AFP和PIVKA-Ⅱ诊断HCC的ROC曲线的AUC分别为0.544(95%CI:0.473~0.613,P<0.05)、0.774(95%CI:0.712~0.829,P<0.05)和0.847(95%CI:0.790~0.893,P<0.05),灵敏度分别为53.1%、66.7%和76.7%,特异性分别为61.7%、86.0%和87.3%;三者联合诊断HCC的ROC曲线的AUC为0.795(95%CI:0.697~0.893,P<0.05),灵敏度为83.0%,特异性为67.0%。结论肝癌组HBcrAg高于慢乙肝组、肝硬化组和肝癌术后组。在核苷类似物治疗情况下,HBcrAg单一指标不能很好地对肝癌进行预测,HBcrAg联合AFP、PIVKA-Ⅱ可提高肝癌诊断的灵敏度。

重组乙肝病毒核心基因DNA与表面抗原-抗体共免疫应答研究

目的:了解小鼠对乙肝病毒核心抗原(HBcAg)基因免疫及与乙肝表面抗原-抗体复合物(HBsAg-抗HBs)联合免疫的应答。方法:用表达乙肝病毒核心抗原N端144个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc144)100μg及含1μgHBsAg的重组乙肝表面抗原-鼠抗体组建的复合物(简称sIC)免疫Balb/c小鼠。用ELISA法检测血清抗体IgG和IgG1、IgG2a亚类的效价。用半定量PCR法分别检测鼠脾细胞IFN-γ及IL-4的mRNA。结果:pHBc144及sIC联合免疫鼠的抗HBs IgG、IgG1、IgG2a效价均显著高于sIC组(P＜0．05)。同时小鼠还可产生抗HBc及由HBsAg、HBcAg特异诱生的IFN-γ及IL-4。但与sIC共免疫,小鼠对HBcAg诱生的IFN-γ mRNA有所降低。结论:可用HBcAg基因与sIC共免疫,以获得针对乙肝病毒2种结构蛋白的免疫应答。

辨病与辨证治疗乙肝病毒相关抗原性肾病体会

乙肝病毒相关抗原性肾病是指乙肝病毒感染引起的肾小球肾炎,是常见的继发性肾脏疾病,临床主要表现为疲乏无力,或食欲不振,水肿,严重时可出现腹水等肾病综合征表现,或非肾病综合征性蛋白尿。现代医学虽然在抗病毒治疗、抑制病毒复制方面具有明显的优势,但在控制蛋白尿、改善患者症状、提高生活质量及延缓肾功能损害等方面,中医、中药仍存在一定的优势。现总结如下。

乙肝病毒核心抗原DNA疫苗诱导小鼠抗原特异性CD8^+T细胞动态变化和动态分布

目的 :研究乙肝病毒核心抗原 (HBcAg)DNA疫苗诱导的细胞免疫应答。方法 :用表达乙肝病毒核心抗原N端1 4 4个氨基酸的重组质粒DNA(简称pHBc1 4 4 ) 1 0 0 μg免疫C5 7BL 6小鼠 ,用细胞内细胞因子染色技术检测小鼠体内抗原特异性CD8+ T细胞的动态变化。结果 :pHBc1 4 4免疫后抗原特异性CD8+ T细胞逐渐增多 ,在初次免疫的第 1 4天出现第一个免疫应答高峰 ,此后抗原特异性CD8+ T细胞数量逐渐下降进入免疫记忆期并在 1年内维持在稳定水平。加强免疫后在第 1 0天抗原特异性CD8+ T细胞数量达到高峰 ,约是初次免疫应答高峰的 2倍 ,此后抗原特异性CD8+ T细胞数量逐渐下降 ,但下降的速度比初次免疫应答减缓。结论 :pHBc1 4

100例乙肝患者乙肝病毒核心抗原与转氨酶的对比观察

HB_cA_g是乙肝病毒(HBV)的核心成份,存在于Danes颗粒的核心和乙肝患者的肝细胞核内,故HB_cA_g是HBV复制的直观标志物,转氨酶也是肝炎患者较敏感的指标,为了了解HB_cA_g与转氨酶的关系,本文收集了HBVm阳性血清标本进行HD_cA_g检测,现分述如下。 1

嵌合新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原病毒样颗粒的构建及表达

目的:制备嵌合结肠癌新抗原Adpgk的乙肝病毒核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLP)。方法:通过重叠PCR将新抗原编码序列插入截短型HBcAg(1~149 aa)第78、79位氨基酸编码序列之间,并将融合基因克隆至原核表达载体pET-22b(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后,利用亲和层析与超滤管纯化浓缩目的蛋白,通过Western印迹、粒径分析与透射电镜成像鉴定嵌合病毒样颗粒。结果:构建了pET-22b(+)重组表达载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),SDS-PAGE结果显示在30℃经1 mmol/L IPTG诱导5 h即可获得高浓度的可溶性蛋白,通过亲和层析与超滤浓缩得到了纯度良好的目的蛋白;Western印迹结果表明连有His标签的目的蛋白获得表达且浓度较高;透射电镜成像可见密集的大小均一、空心的球形病毒样颗粒结构。结论:制备出浓度与纯度良好且组装正确的嵌合HBcAg VLP。

乙肝e抗原与乙肝病毒含量的相关性分析

目的对乙肝e抗原(HBe Ag)与乙肝病毒含量的相关性进行讨论研究。方法 300例乙型肝炎患者,均进行乙肝病毒DNA含量检测和乙肝两对半检查[乙肝表面抗原(HBs Ag)、乙肝表面抗体(HBs Ab)、HBe Ag、乙肝e抗体(HBe Ab)、乙肝核心抗体(HBc Ab)],通过检测结果各指标数据变化情况分析HBe Ag与乙肝病毒含量的相关性。结果乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+)HBe Ag(-)HBe Ab(-)HBc Ab(+)共有6例患者,其中乙肝病毒DNA含量检测结果 (105~107)copies/ml检测率50.00%明显高于乙肝病毒DNA含量检测结果 <105 copies/ml检测率16.67%和>107 copies/ml检测率33.33%;另外乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+)HBe Ag(-)HBe Ab(+)HBc Ab(+)共174例患者,其中其中乙肝病毒DNA含量检测结果 <105 copies/ml检测率70.69%明显高于乙肝病毒DNA含量检测结果 (105~107)copies/ml检测率16.10%和>107 copies/ml检测率13.21%;最后乙肝两对半检测结果为HBs Ag(+)HBe Ag(+)HBe Ab(+)HBc Ab(-)共120例患者,其中乙肝病毒DNA含量检测结果 >107 copies/ml检测率66.67%明显高于乙肝病毒DNA含量检测结果 (105~107)copies/ml检测率33.33%。结论 HBe Ag与乙肝病毒含量之间存在高度线性关系,且不属于典型的正相关,因此,无法仅仅根据乙肝抗原抗体检查结果对乙肝病毒的传染性强弱和复制程度进行判断。乙肝DNA测定可直接反映乙肝病毒的含量,具有直接性,是评价病毒复制、传染性大小、抗病毒药物治疗疗效的最可靠的指标。