乙肝表面抗原a表位粘膜疫苗的构建及免疫原性检测

利用DNA重组技术 ,构建霍乱毒素B亚单位与乙肝病毒表面抗原a表位的融合基因 ,并在大肠杆菌表达体系pET 30a BL2 1 (DE3)中获得以包涵体形式的高效表达。免疫印迹表明表达产物具有免疫学活性 ,包涵体复性后 ,表达产物能够象CTB那样形成五体 ,以腹腔注射、灌胃。

乙型肝炎病毒s基因变异株抗原表位的研究

对HepG2细胞表达的HBsAg的点突变体129Ha、142Lf、145Rb、143Sg和148及野生型HBsAgb3进行了初步纯化及抗原表位的研究，发现这些突变体的颗粒密度与野生型HBsAg差异无显著意义，约为1．2；用5种HBsAga决定簇的单克隆抗体对其表位进行分析，发现129Ha、142Lf、145Rb和142Sg与这5种单抗的结合力与野生型HBsAg差异大显著意义，但148突变体的表位与野生型HBsAg明显不同，其原因还有待进一步研究。

表面表位包埋法制备肿瘤表面抗原P185^(neuc-erbB-2)单克隆抗体及其性质研究

目的 :细胞表面表位包埋法 (SEM)是一种选择细胞表面特定的表达分子制备单克隆抗体的新途径。由于P185 neu c erbB 2 是乳腺癌及其他肿瘤的一个重要表面标志 ,这个研究旨在应用SEM法制备特异性好 ,灵敏度高的P185单克隆抗体并分析其特性以便于临床。方法 :采用细胞表面表位包埋法免疫BALB C小鼠 ,常规杂交瘤技术进行细胞融合 ,ELISA法测定 ,有限稀释法克隆化。结果 :筛选得到 3株能稳定分泌抗人癌基因erbB 2产物P185蛋白的McAb杂交瘤细胞。经间接免疫过氧化物酶染色和流式细胞术分析证明该McAb特异性与P185阳性细胞膜结合 ,而不与结构类似的EGFR膜阳性细胞结合。免疫印迹实验证明这些McAb特异地与P185蛋白结合 ,病理切片免疫组化结果证明该单抗对乳腺癌组织呈特异膜阳性反应。结论 :SEM法制备的肿瘤表面抗原P185的McAb杂交瘤具有很好的用于临床诊断肿瘤抗原P185的价值及工程化改造的前景。

流行性乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ的抗原表位鉴定与功能研究

流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种严重危害人畜健康的虫媒病毒.表面囊膜蛋白(E蛋白)是该病毒的主要结构蛋白.E蛋白在介导病毒与宿主细胞的吸附、融合,决定病毒的血凝活性、细胞嗜性以及决定病毒毒力和诱导宿主产生保护性免疫反应中起重要作用.E蛋白结构域Ⅲ(EⅢ)是诱导中和抗体的重要区域.为确定乙型脑炎EⅢ的抗原表位,实验首先克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的EⅢ区域,并用pGEX-6P-1载体进行融合表达,免疫印迹分析表明,该融合蛋白能被抗JEV血清识别.为了进一步对该结构域进行抗原表位作图,设计了14个覆盖该区域且部分重叠的短肽.将各短肽与GST进行融合表达与纯化.短肽融合蛋白经JEV阳性血清免疫印迹和ELISA免疫反应性扫描分析,结果鉴定出,E39(305TEKFSFAKNPVDTGHG320)、E45-1(355VTVNPFVATSSA366)、E48-1(377PFGDSYIV384)和E49(385VGRGDKQINHHWHKAG400)4个线性抗原表位.分别将4个抗原表位融合蛋白免疫小鼠,制备各抗原表位单因子血清,结果经体外病毒中和试验表明,E39为具有病毒中和活性的抗原表位.试验结果为进一步分析JEVE蛋白结构与功能以及诊断试剂和表位疫苗的研究提供了重要工作基础.

传染性法氏囊病病毒抗原表位与乙型肝炎病毒核心抗原嵌合基因的构建及其表达产物分析

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)多表位基因5epis的免疫效力,本研究应用重叠延伸PCR技术,在乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)基因的231位～232位核苷酸(77位～78位氨基酸残基)之间插入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,构建基于HBcAg修饰基因(mHBc)的抗原表位嵌合体基因分子载体pET-mHBc。将编码IBDV多表位基因5epis定向插入到pET-mHBc的mHBc基因中,获得嵌合体基因mHBc-5epis表达重组质粒pET-mHBc-5epis,并在大肠杆菌中表达。经SDS-PAGE分析,重组嵌合体蛋白的分子量约29 ku,表达量约占菌体总蛋白的47.6%;Western blot结果表明,重组嵌合体蛋白可与IBDV抗体反应形成1条特异性蛋白带;重组嵌合体蛋白呈病毒样颗粒(VLP),直径约100 nm～120 nm;用IBDV抗体夹心ELISA检测,抗原效价达到1∶200。本实验成功构建了5epis与HBcAg嵌合体基因,并在大肠杆菌中高效表达,具有IBDV抗原反应性的重组病毒样颗粒嵌合体蛋白,为研究其表位型基因工程疫苗提供了新途径。

鸭坦布苏病毒E蛋白抗原表位的鉴定及其表位交叉反应性分析

为鉴定鸭坦布苏病毒(DTMUV)E蛋白的抗原表位,本研究以纯化的抗DTMUV E蛋白单克隆抗体(MAb)3B6为固相筛选分子,对噬菌体随机12肽库进行淘选,通过对阳性噬菌体克隆测序分析,确定DTMUV E蛋白的模拟表位氨基酸序列,将模拟表位序列与GST蛋白融合表达并进行western blot验证。利用DNAStar对表位序列进行同源性分析,并通过dot blotting方法分析抗原表位在黄病毒阳性血清间的交叉反应性。结果鉴定了DTMUV E蛋白的一个线性抗原表位EVEPPFG,并且该表位在DTMUV与其它黄病毒中均具有高度的保守性。Dot blotting结果显示抗原表位EVEPPFG在黄病毒阳性血清间具有交叉反应性。因此,EVEPPFG为黄病毒共享型的抗原表位,这对于黄病毒E蛋白的抗原结构功能的研究以及研制表位疫苗和诊断抗原等具有重要意义。

HBV细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体在真核细胞中的表达及其腺病毒载体的构建

目的:构建乙型肝炎病毒表面抗原细胞毒性T细胞抗原表位单链三聚体(HBsAg-SCT)真核表达载体,在真核细胞293T中表达,并构建含HBsAg-SCT的腺病毒载体。方法:合成H-2Ld限制的HBsAg细胞毒性T细胞表位寡核苷酸,与H-2Ld分子融合,构建含HBsAg-SCT的真核表达载体,并转染293T细胞,采用流式细胞技术观察HB-sAg-SCT在细胞表面的表达。将HBsAg-SCT亚克隆到腺病毒载体,转染293A细胞,包装产生携带HBsAg-SCT的重组腺病毒。结果:成功构建了HBsAg-SCT真核表达载体,并在真核细胞中表达。利用重组腺病毒载体制备出高滴度的重组腺病毒。结论:含HBsAg-SCT的真核表达载体能够在真核细胞表面有效表达,获得含HBsAg-SCT的重组腺病毒,为研究HBsAg-SCT免疫治疗HBV感染打下基础。

弓形虫微线蛋白16抗原表位区的预测及酵母表面展示

目的应用生物信息学软件预测弓形虫微线蛋白16(TgMIC16)B/T细胞抗原表位并对抗原表位区进行酿酒酵母菌的表面展示。方法利用DNAStar和IEDB对TgMIC16进行B细胞抗原表位预测,利用SYFPEITHI和BIMAS预测其T细胞抗原表位。参照预测结果,采用pCTCON2/EBY100展示系统对抗原表位区进行酵母表面展示,利用间接免疫荧光(IFA)和流式细胞仪检测表达情况。结果 TgMIC16存在潜在的B/T细胞抗原表位且集中在aa343-625区域;该抗原表位区成功展示到酵母细胞表面,最佳诱导时间为24~36h。结论为下一步酵母载体疫苗的研制及疗效评价奠定基础。

从噬菌体表面展示肽库中筛选衣原体单克隆抗体识别的抗原表位

利用抗体捕获法 ,经三轮淘洗 ,从表面展示随机肽序列的噬菌体文库中筛选到与衣原体单克隆抗体C17特异结合的噬菌体克隆 ,其一致序列为 :(L/I)PGGS(P/W ) ,竞争抑制实验表明含特异序列的克隆能与天然抗原竞争。据此 ,我们认为此序列为衣原体的B细胞抗原表位。

辅助性T细胞表位HBV表面抗原融合基因真核表达质粒的构建

为提高HBVDNA疫苗的免疫效率,将一个通用型辅助性T细胞表位基因引入HBV表面抗原基因的5’末端,构建成真核表达质粒。PCR方法合成PADRE-HBsAg目的基因,产物与pMD18T载体连接,经HindⅢ,EcoRI双酶切,再克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)。酶切及测序鉴定,该真核表达载体构建成功,为进一步观察其特异性细胞和体液免疫反应奠定了基础。

含preS2免疫表位乙型肝炎表面抗原DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答

目的 探讨含preS2免疫表位基因质粒DNA疫苗诱导小鼠的免疫应答。方法 质粒转染COS 7细胞 ,用ELISA法测定瞬时表达产物。质粒经碱裂解法大量提取 ,Sepharose 4FF柱层析纯化后 ,直接肌肉注射免疫NIH小鼠。检测小鼠的体液免疫和细胞免疫应答效果。结果 preS2表位多肽和HBsAg高效表达。免疫小鼠血清中检测到高滴度的抗 HBs和抗 preS2。淋转刺激指数SI和IL 2活性 ,质粒DNA疫苗与单纯主蛋白疫苗免疫对照组比较 ,差异有显著意义。

肺炎链球菌表面粘附素A蛋白抗原表位的预测筛选及确定

【目的】确定肺炎链球菌表面粘附素A(Psa A)蛋白抗原的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞表位。【方法】通过生物信息学方法预测肺炎链球菌Psa A蛋白分子小鼠B细胞线性表位、MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)及MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)并人工合成相应肽段;克隆重组质粒BL21/p ET/Psa A并得到纯化的r Psa A蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组和对照组小鼠的血清分别与人工合成的候选B细胞表位肽段进行间接ELISA检测,筛选B细胞表位;分离小鼠脾及淋巴结细胞并分别与人工合成的T细胞候选表位肽段体外共培养,取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ的量进行初步筛选。用初筛到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式检测,确定Psa A蛋白分子T细胞表位。【结果】分析Psa A蛋白分子的B细胞表位及MHC-Ⅰ结合肽、MHC-Ⅱ结合肽;得到候选B细胞表位肽10条,MHC-Ⅰ结合肽21条,MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了r Psa A蛋白并成功免疫了小鼠。间接ELISA结果显示:肽段PB2、PB6,PB7与r Psa A免疫小鼠的血清发生反应,其OD450nm读数比相应的阴性对照小鼠显著升高;双夹心ELISA结果初步提示:肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高。细胞流式结果进一步确定:经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较对照小鼠细胞显著升高;经肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较对照小鼠细胞显著升高。【结论】确定了肺炎链球菌Psa A蛋白分子的3个B细胞线性表位;2个CD4 T细胞表位;3个CD8 T细胞表位。

MUC1抗原的B细胞表位预测

目的 预测MUC1抗原的B细胞表位。方法 联合运用多种方法对MUC1的二级结构和表面特性,如理化 性质、亲水性、可塑性、溶剂可及性及免疫原性等方面进行分析,预测MUC1的抗原表位。结果 MUC1存在有多个潜在的 抗原表位位点,可能的蛋白质抗原表位区域:1 -10,24 -54,65 -77,84 -91,108 -134,140 -156,159 -174,179 -196,199- 210,220- 233, 237- 265,270- 299,316 -337,351 -362,369- 396,411- 420,445 -502。结论 应用多参数预测MUC1抗原的B细胞表位,为进一步 研究MUC1结构和功能、构建MUC1突变体和选择表达新型MUC1分子奠定了基础。

外源抗原表位在大肠杆菌CS3菌毛上的呈现

为了探讨CS3菌毛多位点用于外源表位呈现以及重组蛋白的免疫原性 ,通过对CS3亚基蛋白二级结构、抗原表位、亲水性及柔韧性的预测分析 ,找出了两个新的插入位点 72位和 136位 ,将口蹄疫病毒VP1、脊髓灰质炎病毒C3等多种表位插入到CS3中 ,全细胞ELISA、免疫荧光检测和电镜观察等均表明外源表位在大肠杆菌表面得到了表达 ,而且 72位表达水平明显高于 136位。用重组菌腹腔注射免疫小鼠 ,可诱发机体产生针对CS3和外源表位的双重免疫应答。以上结果表明 ,CS3上有多个位点可实现外源表位的表面呈现 ,可望成为研制多价基因工程活菌疫苗的表达载体。

噬菌体展示随机肽库及其在抗原表位研究上的应用

本文主要介绍了噬菌体展示系统的原理,并就噬菌体表面展示系统的不同表达载体类别,分别做了描述, 同时讨论该展示系统在抗原表位研究上的应用。

HBsAg交叉抗原表位的存在及其临床意义

目的探讨牛血清HBsAg样蛋白的性质,为HBV的发病机制、防治等研究提供新思路。方法采集HBsAg样蛋白阳性的牛血清,以质谱对其进行序列测定;以DNAstar软件对蛋白质表位进行分析;以二维凝胶电泳分离的HBsAg样蛋白免疫小鼠,获得抗血清,Western blot分析HBsAg和抗牛HBsAg样蛋白抗血清的交叉反应性。结果发现该目的蛋白为牛血清中的载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ),经Blast显示HBsAg与ApoA-Ⅰ无同源性。生物学软件分析进一步显示,虽然两种蛋白质在一级结构水平无任何同源性,但HBsAg的41-74aa位与ApoA-Ⅰ的37-73aa位氨基酸可能存在交叉表位;Western blot分析证明牛ApoA-Ⅰ与HBsAg存在交叉反应。结论牛血清ApoA-Ⅰ与HBsAg具有交叉表位,该蛋白在HBV的防治中可能具有重要的意义。

Pla a 1的抗原表位分析

[目的]预测Pla a 1抗原的免疫原性及B细胞表位。[方法]联合运用多种方法预测Pla a 1的二级结构并预测其表面特性,如亲水性、可塑性及抗原表位。[结果]该蛋白是一个分子量约19 kDa,pI值约8.7,主要为α-螺旋的结构紧凑的球形蛋白。预测其亲水性区域:32-42,55-59,76-78,88-89,92-98,110-112,118-127,140-151,157-163;预测其可塑性区域:28-40,49-57,76-80,87-98,109-114,121-125,137-139,144-151,154-162;预测其蛋白质抗原表位区域:29-42,49-60,75-78,86-100,107-114,116-130,134-152,156-164;预测其转角结构区域:39-42,51,55,88-89。[结论]Pla a 1抗原蛋白具有较强的免疫原性;其主要的抗原表位集中于29-42,49-60,86-100,而这些预测结果为进一步寻求梧桐花粉变态反应的防治方法提供了依据。

噬菌体递呈肽库在蛋白质抗原表位分析中的应用

本文介绍了线状噬菌体递呈系统的原理及应用特点。讨论了随机噬菌体肽库和靶基因表位递呈文库在蛋白质抗原表位分析中的应用。

乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位融合蛋白(S/preS1)在CHO细胞中的稳定高效表达

含前S蛋白的重组乙型肝炎疫苗是第3代乙肝疫苗研发的重点，有望替代现在广泛使用的基因工程疫苗。构建表达乙肝病毒S抗原和preS1抗原表位（21．47位氨基酸）融合蛋白（S／preS1）的真核表达载体HMRcHEF53u／Neo-S／preSl并转染CHO—S细胞，经ELISA和有限稀释克隆筛选获得了S／preS1表达效率高、体外培养生物学性状好的CHO细胞系10G6。Westernblotting分析证实10G6表达的S／preSI同时保留s和preSl的天然免疫原性。10G6细胞在以活细胞密度和preSI／S浓度为评价指标的连续批次培养过程中保持着稳定的目的产物表达效率和良好的生长特性。采用无血清流加培养工艺，10G6细胞的活细胞密度和preSl／s浓度分另1达至07×10^6～10×10^6cells／mL和17～20mg／L。