乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白与X蛋白对肾小管上皮细胞核转录因子的影响

目的:目的研究167例乙肝病毒截短型表面抗原中蛋白(C-terminally truncated middle size surface proteins,MHBst167)和X蛋白(hepatitis B virus X protein,HBx)对肾小管上皮细胞核转录因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)活化的影响及其相关机制探讨。方法:肾小管上皮细胞系(HK-2)转染mhbst167或(和)hbx后,蛋白印迹法检测NF-κB核易位及其抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor-kappa B,IκBα)磷酸化水平的变化,凝胶电泳迁移率和双萤光素酶报告基因分析进一步检测NF-κB活性;通过对蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)活性和细胞外调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平检测探讨NF-κB活化的机制。结果:HK-2细胞转染mhbst167或(和)hbx基因后,NF-κB核易位、磷酸化IκBα、κB结合活性及κB基因转录均增加(P<0.05);且PKC激酶活性和磷酸化ERK水平也增加(P<0.05),而Raf蛋白均无表达。结论:在肾小管上皮细胞中,MHBst167/HBx可能通过PKC/ERK通路(非Raf依赖性)活化NF-κB。

新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗在中国猕猴体内免疫原性初步研究

目的:观察乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBs)核酸疫苗在中国猕猴体内的体液和细胞免疫应答。方法:实验用中国猕猴实验组、对照组各2只,分别在第0、8、16、24、48周肌肉注射法接种核酸疫苗(pSW3891/MHBs)或对照载体(pSW3891)。ELISA法检测中国猕猴血清抗-HBs,CFSE-PI染色FCM(流式细胞术)法测定中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应。结果:实验组中国猕猴血清抗-HBs滴度在72周达到最高峰,最高滴度分别为1∶6400和1∶12800,对照组抗-HBs滴度始终保持在1∶50。实验组中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg特异性增殖反应明显增强,细胞分裂指数分别为18.64和14.70,而对照组细胞分裂指数分别为1.62和2.61。结论:建立了CFSE-PI染色流式细胞仪检测法来检测中国猕猴外周血淋巴细胞HBsAg抗原特异性增殖反应,方法创新,实用可靠。新型乙肝表面抗原中蛋白核酸疫苗pSW3891/MHBs在中国猕猴体内能产生良好的特异性体液和细胞免疫应答。

乙肝表面抗原结合蛋白的红色荧光示踪分子的表达纯化和功能鉴定

乙肝表面抗原结合蛋白（HBsAg binding protein，SBP）是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白，已被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用。DsRed—Monomer是来源于DsRed的人工突变体，作为蛋白表达的报告基因在真核细胞中使用。为探究SBP的作用机理，通过基因工程方法将该基因与DsRed—Monomer基因连接，克隆到原核表达载体，表达带有红色荧光的融合蛋白，该蛋白通过荧光激发检测显示荧光强度与蛋白量成正比例关系。同时该融合蛋白经过ELlSA方法检测可以与HBsAg特异性结合，使用常规方法和荧光量检测两种方法测定得到的该蛋白与HBsAg的亲和常数相似。首次证实了DsRed—Monomer在原核表达中可作为报告基因进行研究和使用，建立了利用荧光量检测蛋白的方法，与常规ELISA方法比较证明，大大缩短了试验时间和步骤，可以更方便的应用于分子示踪及其功能研究。

e抗原阴性慢性乙肝患者血清中乙肝表面抗原大蛋白的表达

目的探讨血清乙肝表面抗原大蛋白(LHBs)在HBeAg阴性慢性乙型肝炎中的诊断价值。方法以乙肝恢复期血清标本20例为对照,检测119例HBeAg阴性血清标本LHBs,PreS1和HBV DNA表达情况,并进行对比分析。结果该研究中HBeAg阴性乙肝血清标本,LHBs,PreS1和HBV DNA均有较高的阳性率,三者差异无显著性:64.4%的乙肝“小三阳”患者血清LHBs与HBV阴阳性一致,高于PreS1的56.4%。LHBs可检出84.3%的HBeAg阴性慢性乙肝患者,高于PreS1的56.9%,但约40%的LHBs阳性血清标本HBV DNA为阴性。结论尽管LHBs在乙肝急性期可能存在较大的临床意义,但并非HBeAg阴性慢性乙型肝炎诊断的理想指标。

乙肝免疫球蛋白联合恩替卡韦在乙肝表面抗原阳性供肾移植受者中的应用效果

目的观察乙肝免疫球蛋白联合恩替卡韦在乙肝表面抗原(HBsAg)阳性供肾移植受者中的应用效果。方法选择2016年5月-2017年12月于南华大学附属第二医院接受治疗的肾移植患者15例,均为HBsAg阳性肾移植受者接受HBsAg阳性供肾,患者植入供肾前,取乙肝免疫球蛋白400 U注入至HTK保存液100 ml中,经肾动脉灌注肾脏中,术后给予乙肝免疫球蛋白联合恩替卡韦治疗。随访3~36个月,观察患者肾移植情况、肝肾功能、乙肝DNA复制情况、耐药与HBV DNA转阴情况。结果15例肾移植患者中,移植肾功能延迟恢复1例(6.67%),移植后出现排斥反应患者1例(6.67%)。15例患者移植肾均存活,移植肾存活率为100.00%;15例患者均存活,存活率为100.00%。术后3周,患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、血肌酐、乙肝DNA分别为(66.93±10.35)U/L、(52.98±11.47)U/L、(113.07±24.98)μmol/L、(1~5)×10^(2),无急性肝衰竭与肝肿瘤发生,肺部感染发生率为33.33%(3/15);均未发生耐药反应,HBV DNA转阴率为86.67%(13/15)。结论HBsAg阳性肾移植受者可接受HBsAg阳性供肾,治疗过程中给予乙肝免疫球蛋白联合恩替卡韦治疗可有效预防乙肝短期爆发的发生,对患者术后机体康复具有重要意义。

乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄的遗传转化体系的建立

以丽春番茄无菌苗的子叶为外植体,以农杆菌菌株EHA105(包含质粒pBin438S)为载体,将乙肝表面抗原小蛋白S基因导入番茄组织中.基本培养基采用MS+6-BA1 0mg/L+IAA0 2mg/L,在共培养时加入乙酰香酮100μmol/L作为诱导剂,经过组织培养得到转基因植株.对转化植株基因组进行的分子学PCR检测表明,外源基因有可能已整合到番茄基因组中.该转基因遗传体系的建立为利用转基因植物生产乙肝口服疫苗奠定了基础.

乙肝表面抗原大蛋白与HBV DNA的比较及其与ALT的关系

目的:检测不同模式乙肝患者血清中乙肝表面抗原大蛋白(HBV-LP)、乙肝前S1,HBV DNA以及ALT,比较HBV-LP以及乙肝前S1的检出与HBV DNA及ALT之间的关系,探讨HBV-LP用于乙肝患者临床诊断的意义．方法:采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测177例HBV患者血清HBV-LP和乙肝前S1,荧光定量PCR方法检测患者HBV DNA,全自动生化分析仪检测ALT．结果:相同乙肝模式患者血清HBV-LP与HBV DNA检出率无显著差异;HBeAg阳性患者血清中HBV-LP与HBV DNA阳性率均明显高于HBeAg阴性患者(95．45％vs 44．36％,P<0．05; 93．18％vs 41．35％,P<0．05):相同乙肝模式患者血清乙肝前S1的检出低于HBV DNA的检出,两者差异显著(P<0．05);HBV-LP阳性患者的ALT明显高于HBV-LP阴性患者．结论:乙肝表面抗原大蛋白与HBV DNA有较高的符合率,是反映乙肝患者体内病毒复制情况的可靠指标;而且乙肝表面抗原大蛋白阳性患者ALT较阴性患者高,表明HBV-LP同时也反映了乙肝病情的活动情况．

应用表达谱芯片技术对截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原截短型中蛋白(MHBst)的反式调节基因.方法:构建MHBst基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-MHBst,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-MHBst转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染MHBst后,有37条差异基因表达,其中14条基因表达增强,23条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式调节基因,为进一步阐明乙型肝炎病毒表面抗原截短型中蛋白的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

酵母双杂交技术筛选肝细胞中与羧基末端截短型乙型肝炎表面抗原中蛋白MHBs^(t167)蛋白结合蛋白的研究

目的应用酵母双杂交技术筛选人肝细胞cDNA文库中与羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst167)具有相互作用的肝细胞蛋白,以探讨MHBst167可能的生物学功能。方法用多聚酶链反应(PCR)法扩增MHBst167基因,应用酵母双杂交系统3,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转染酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转染了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,于涂有Xαgal营养缺陷型培养基(SD/TrpLeuHisAde)上进行双重筛选阳性菌落。挑选阳性克隆,提取此酵母克隆的质粒转化DH5α大肠杆菌并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒DNA,酶切鉴定后进行测序,然后进行生物信息学分析。结果成功构建MHBst167酵母表达载体pGBKT7MHBst167。筛选出阳性菌落28个,经生物信息学分析,最后从肝细胞cDNA文库中筛选出7个与MHBst167特异性结合作用的克隆。其中包括人类核糖基化因子1、胎儿肝全长cDNA克隆、人类醛缩酶B果糖二磷酸(ALDOB)、补体3(C3)、人类血清扩散因子(生长调节素B)、人类BAC(细菌人工染色体)克隆GS1306C12。结论成功克隆出MHBst167基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交技术筛选出7个能与MHBst167蛋白相互作用的肝细胞结合蛋白基因,根据所克隆到的基因,对以后研究MHBst167的生物学功能及乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制奠定了理论基础。

对乙型肝炎患者检测乙肝表面抗原大蛋白和前S1抗原的区别和临床意义

[目的]检测乙肝患者血清中乙肝表面抗原大蛋白（Hepatitis B Virus Large Surface Protein,LHBs）、乙肝前S1、HBV DNA,探讨LHBs用于乙肝患者临床诊断的意义。[方法]采用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测LHBs以及乙肝前S1,采用化学发光方法检测乙肝两对半,采用荧光定量PCR方法对患者HBV DNA进行检测。[结果]（1）相同乙肝模式患者血清LHBs与HBV DNA检出率比较差异无显著性意义（P〉0.05）;（2）HBeAg阳性患者血清中LHBs与HBV DNA阳性率均明显高于HBeAg阴性患者,差异有显著性意义（P〈0.05）;（3）相同乙肝模式患者血清乙肝前S1的检出低于HBV DNA的检出,两者相比较差异有显著性意义（P〈0.05）。[结论]LHBs可以弥补由于乙肝病毒变异引起的HBeAg检测的不足,LHBs可以反映病毒复制。

对乙型肝炎患者检测乙肝表面抗原大蛋白和前S_1抗原的区别和临床意义

目的检测乙型肝炎(下称乙肝)患者血清中乙肝表面抗原大蛋白(LHBs)、乙肝前S1、HBV-DNA,探讨LHBs用于乙肝患者临床诊断的意义。方法采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测LHBs以及乙肝前S1,采用化学发光方法检测乙肝两对半,采用荧光定量PCR方法对患者HBV-DNA进行检测。结果 (1)相同乙肝模式患者血清LHBs与HBV-DNA检出率差异无统计学意义(P>0.05);(2)HBeAg阳性患者血清中LHBs与HBV-DNA阳性率均明显高于HBeAg阴性患者,差异有统计学意义(P<0.05);(3)相同乙肝模式患者血清乙肝前S1的检出低于HBV-DNA的检出,两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LHBs可以弥补由于乙肝病毒变异引起的HBeAg检测的不足,并在一定程度上反映了乙肝患者肝功能状况。

羧基末端截短的HBV表面抗原中蛋白反式激活c-myc表达

目的构建羧基末端截短的乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(MHBst)反式激活基因的消减文库,并观察其对细胞原癌基因c-myc的反式激活作用。方法以重组表达质粒pcDNA3.1(-)-MHBst和空载体pcDNA3.1(-)瞬时转染HepG2细胞,提取细胞mRNA并逆转录为cDNA,分别标记为实验组与对照组,应用抑制性消减杂交技术,构建MHBst反式激活的cDNA消减文库。针对其中的原癌基因c-myc,进一步克隆其启动子序列并构建报告基因表达载体pCAT3-c-myc,与pcDNA3.1(-)-MHBst共转染HepG2细胞,ELISA法检测报告基因氯霉素乙酰转移酶CAT的表达活性。同时,应用反转录聚合酶链反应和免疫印迹方法检测表达MHBst的细胞中c-myc基因的mRNA转录和蛋白表达水平。结果随机挑选消减文库中的50个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,显示19种已知功能基因,涉及细胞代谢、信号转导、细胞凋亡和肿瘤发生等生物学过程。细胞内瞬时表达的MHBst蛋白能够反式激活细胞原癌基因c-myc启动子的转录活性,并且RT-PCR和Western blotting结果也证明了表达MHBst蛋白的细胞中原癌基因c-myc的表达水平明显增强。结论成功构建MHBst反式激活基因的消减文库,MHBst可以反式激活细胞原癌基因c-myc的表达,为深入了解乙型肝炎病毒致癌的分子生物学机制提供理论基础。

乙肝病毒表面抗原大蛋白的检测与分析

[目的]检测乙肝病人血液中乙肝病毒表面抗原大蛋白(LHBs),与HBV DNA结果比较,探讨LHBs方法的可靠性和实用性。[方法]用荧光定量PCR法检测慢性HBV病人血中HBV DNA,ELISA法检测LHBs,时间分辨荧光免疫法测定HBV标志物模式。[结果]96份HBsAg、HBeAg、抗-HBc阳性标本,其HBV DNA与LHBs阳性率分别为97.9%和93.8%;28份HBsAg、抗-HBe、抗-HBc阳性标本,HBV DNA与LHBs检出率分别为57.1%和64.3%,两法的一致度达96.4%(P>0.05)。[结论]LHBs和HBV DNA的检测率有很好的相关性,其评估HBV的复制与HBVDNA检测具有同等意义。LHBs检测仪器设备要求低、操作简单,多数医疗机构都能开展,对不能开展HBV DNA检测的基层医院临床意义更大。

酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白相互作用的肝细胞蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白(Middle hepatitis B surface protein,MHBs protein)相互作用的肝细胞蛋白。方法 PCR扩增MHBs编码基因并将S区起始密码子突变,获得目的基因MHBs-mut,克隆于诱饵载体pGBKT7。在证实MHBs-mut蛋白不具有自激活作用的前提下,以酵母双杂交系统筛查与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白,并在酵母细胞内验证蛋白的相互作用。结果构建酵母双杂交诱饵载体,获得重组质粒pGBKT7-MHBs-mut。Western blot显示其在酵母中表达MHBs-mut蛋白。酵母双杂交筛选并验证,得到与MHBs-mut蛋白相互作用的肝细胞蛋白:COP9信号体第五个亚单位(COPS5,又名C-Jun结合蛋白1,c-Jun-activation-domain binding protein 1,JAB1)。结论乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白与COPS5在酵母AH109细胞中具有相互作用。

乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白研究进展

目前对乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急性、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的治疗,还没有理想的疗效.利用新型技术对HBV感染肝细胞的相关受体蛋白进行研究,即对HBV表面抗原中蛋白结合蛋白进行筛选是一个重要的研究方向.HBV进入肝细胞之后,其基因组在肝细胞内具有顺式和反式两种调控方式.HBV蛋白对肝细胞基因组的反式调节作用影响了肝细胞的基因表达谱,从而对肝细胞的生长、代谢及恶性转化产生重要影响.研究羧基末端截短的表面抗原中蛋白的结合蛋白可能是阐明HBV感染慢性化及引起肝细胞癌的重要分子生物学机制之一.

乙肝表面抗原对人肝癌系HepG2细胞增殖及I型胶原、α-平滑肌肌动蛋白分泌的影响

目的探讨人肝癌细胞系Hep G2中乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag)对该细胞增殖及I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)分泌的影响。方法采用含不同浓度HBs Ag的培养基对Hep G2细胞组(A组)、LX-2和Hep G2共培养组(B组)细胞进行培养,CCK-8法观察不同浓度的HBs Ag对两组Hep G2细胞增殖的影响,并设含普通培养基的Hep G2组(C组)和LX-2和Hep G2共培养组(D组)进行比较;ELISA法观察敏感浓度的HBs Ag对各组Hep G2细胞Col I、α-SMA分泌的影响。结果随着HBs Ag浓度的升高,各组Hep G2细胞增殖率呈上升趋势,且浓度5 ng/ml时增殖率明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。采用5 ng/ml浓度HBs Ag刺激48 h后,与C组比较,A组细胞上清液中Col I和α-SMA水平明显升高,差异有统计学意义(t=3.419,P=0.005;t=4.388,P=0.001);与D组比较,B组Col I和α-SMA表达水平明显升高,差异有统计学意义(t=3.048,P=0.009;t=3.005,P=0.009)。结论 HBs Ag可以促进人肝癌细胞Hep G2的增殖;Hep G2细胞具有分泌Col I和ɑ-SMA的类似肝星状细胞的特质,HBs Ag可能通过刺激肝癌细胞Hep G2和肝星状细胞LX-2共同促进Col I和ɑ-SMA的分泌而促进肝纤维化、肝硬化和肝癌的进展。

一种乙肝表面抗原结合蛋白可作为疫苗佐剂

乙肝表面抗原结合蛋白(HBsAg binding protein,SBP)是本实验室发现的一种可以与乙肝表面抗原HBsAg特异性结合的人源蛋白,该蛋白已经被证实具有增强乙肝疫苗免疫效果的作用.目前,我们已经利用毕赤酵母表达系统获得了能够分泌表达SBP的毕赤酵母表达菌株.本研究通过对上述菌株的发酵产物进行超滤和亲和层析纯化,获得了一定量的高纯度重组SBP蛋白,并利用酶联免疫吸附检测(ELISA)法和表面等离子体共振(SPF)法分别对重组SBP进行了体内外生物学活性的初步检测,证实其具有与HBsAg结合的能力,并求得了二者之间的亲和常数.将重组SBP作为乙肝疫苗增效剂与乙肝疫苗共同免疫小鼠,SBP增效组小鼠与对照组相比,血清中HBsAg抗体显著升高,表明SBP在体液免疫方面对乙肝疫苗具有显著的增效作用.上述结果表明,SBP有望作为乙肝疫苗的免疫佐剂,在乙型肝炎防治方面有重要意义.

硅胶吸附纯化含Pre S蛋白的重组乙肝表面抗原的最佳洗脱条件

目的 确定重组乙肝表面抗原吸附于熔融硅胶后的最佳洗脱条件。方法 以表面抗原活性收率和纯度为考察指标 ,通过正交实验对影响表面抗原硅胶洗脱的主要因素 (pH值 ,盐浓度和表面活性剂浓度 )进行了研究。结果 pH值、盐浓度和表面活性剂浓度都对表面抗原收率有显著性影响 ,且pH值对表面抗原纯度有显著性影响。结论 用含 1mol·L-1氯化钠的0 .0 2 5mol·L-1碳酸钠缓冲液 (pH 10 )洗脱 ,表面抗原的收率和比活最优。

乙肝病毒表面抗原大蛋白与HBV复制状况的相关分析

目的:通过检测慢性乙肝(chronic hepatitis B,CHB)患者血清中乙肝病毒表面抗原大蛋白(large surface protein,LHBs)、HBV DNA以及乙肝病毒标志物(HBsAg/HBsAb、HBeAg/HBeAb、HBcAb,简称HBV-M)模式测定,探讨LHBs与HBV DNA及HBV-M模式间的关系,研究LHBs反应HBV复制情况的可靠性,揭示HBeAg阴性乙肝患者检测LHBs的临床意义。方法:采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对LHBs和乙型肝炎抗原抗体五项进行检测;采用荧光定量PCR方法对HBV DNA进行检测。结果:534份乙肝患者HBV DNA、LHBs、乙型肝炎抗原抗体五项的检测结果显示:LHBs阳性与HBeAg阴性间测定结果差异有统计学意义(P=0.001,χ2=10.847),不同HBV-M模式的HBV DNA与LHBs检出结果差异有统计学意义(P<0.001,χ2=37.8761)。结论:LHBs是从蛋白水平反应HBV感染者体内病毒复制程度的可靠指标,血清中的LHBs与HBVDNA具有较好的相关性,尤其是HBeAg阴性患者LHBs检测可作为体内病毒复制及预后判断的良好血清学指标。