检测血清中抗乙型肝炎X抗体ELISA竞争法的建立及初步应用

应用基因工程表达的乙型肝炎X抗原(HBxAg)和抗-HBx单克隆抗体(抗-HBx McAb),国内首次建立了检测血清中抗-HBx抗体的ELISA竞争法。此方法敏感性高,血清抗-HBx效价达1∶10即可测出:特异性强,与抗-HBs、抗-HBc、抗-HAV和抗-HD等皆无有意义竞争;稳定性和重复性好;而且由于使用了单克隆抗体,可使方法标准化。对200份临床肝炎血清进行了检测,结果显示抗-HBx阳性率为2.5％,此方法可用于流行病学调查及临床诊断。

HBxAg/抗-HBx系统及其意义

乙型肝炎病毒含有4个开读框架,分别称为S、C、P和X区。S区编码产生乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、前-S1抗原和前-S2抗原;C区编码产生乙型肝炎核心抗原（HBcAg）和乙型肝炎e抗原（HBeAg）;P区编码产生DNA多聚酶;X区编码产生一个含154个氨基酸,分子量约17KD的蛋白,即为乙型肝炎X抗原（HBxAg）。自1965年Blumberg等首次发现HBsAg以来,国内外对HBSAg/抗HBs、HBcAg/抗-HBc、HBeAg/抗-HBe

人肝癌及肝硬变中胰岛素样生长因子Ⅱ的表达及其与HBXAg的关系

本文对60例肝癌(HCC)和47例LC(肝硬变)石蜡切片进行了免疫组化研究。结果显示:胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF—Ⅱ)在HCC、癌旁肝和LC中均可阳性表达,其表达强度以HCC最强,癌旁肝和LC次之。在癌旁肝和LC中增生活跃的肝细胞(如:多倍体、双核肝细胞及小多角细胞等),IGF—Ⅱ可呈较强阳性。在HBxAg阳性表达的HCC和LC组织中,IGF—Ⅱ的阳性率明显高于HBxAg阴性的组织(x^2检验,p<0.05)。癌旁肝和LC组织中一种小多角细胞(SPLC)不仅可以表达IGF—Ⅱ,而且还可以表达HBxAg。上述结果提示,IGF—Ⅱ在HCC中可呈强阳性表达,IGF—Ⅱ的作用可能与HCC恶性增殖有关。SPLC为一种增生活跃的幼稚肝细胞,不仅可以表达IGF—Ⅱ而且还呈HBxAg强阳性。我们认为,SPLC较容易受到HBV等致病因子的侵害,而HBV的表达产物—HBxAg可以通过反式调节机制激活IGF—Ⅱ基因并过量表达,致使SPLC增殖。在癌旁肝和LC中部分肝细胞可呈IGF—Ⅱ强阳性表达,说明这部分细胞处于“活跃增殖”状态,是否具有恶性转化趋势,尚待进一步研究。

野生型及突变型乙型肝炎病毒X基因在pGEX-6P-2系统中的克隆、表达、纯化及免疫鉴定

构建野生型和A1762T/G1764A双突变型乙型肝炎病毒(HBV)X基因原核表达系统,为深入研究HBV X基因及其双突变后对HBV慢性感染者病情发展和肿瘤发生的作用奠定基础。从慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因组DNA,经PCR扩增和基因测序,证实并获得野生型及A1762T∕G1764A双突变型HBV X基因。应用TA克隆及亚克隆技术将2基因分别插入pGEX-6P-2载体,构建pGEX-6P-2-hbvxw(野生型)及pGEX-6P-2-hb-vxm(A1762T∕G1764A突变型)重组表达载体;转化入宿主菌进行诱导表达;包涵体复性后,GSTrap FF蛋白纯化柱纯化带有GST标签的野生型和A1762T∕G1764A突变型HBV x抗原(HBxAg);应用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法对表达的野生型和突变型HBxAg进行鉴定。结果SDS-PAGE证实本研究构建的2个表达系统均能高效表达目的蛋白;复性、纯化后野生型和突变型GST-HBxAg分别达到4.88mg/mL和5.07mg/mL;Western blot鉴定证实所纯化的野生型和突变型HBxAg均能被特异性的单克隆抗体所识别;ELISA方法检测显示2种抗原都能成功包被于微量滴定板上并与乙肝患者血清反应。证实本研究成功地构建了野生型和A1762T∕G1764A突变型HBxAg表达系统,为进一步研究A1762T∕G1764A基因突变对肿瘤发生学和慢性HBV感染者疾病进展的作用和分子机制奠定了基础。