NEFL、NRN1在二乙酰吗啡致神经元凋亡中的作用

目的探究神经丝轻链蛋白(Neurofilament light chain,NEFL)、神经突起素(Neu-ritin,NRN1)在二乙酰吗啡致神经元凋亡中的作用。方法建立二乙酰吗啡成瘾SD大鼠模型,分为Control组、Model组,观察各组大鼠脑组织病理形态学改变、凋亡细胞数及凋亡相关因子蛋白质表达变化;Western blot检测各组大鼠脑组织中NEFL、NRN1、Bax和Bcl-2的蛋白表达;采用NEFL慢病毒转染大鼠原代小脑颗粒细胞,使用Western blot技术检测转染效率,分为NC组、Model组和sh-NEFL+M组,使用二乙酰吗啡干预Model组和sh-NEFL+M组。采用CCK-8法检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western blot检测细胞NEFL、NRN1、Bax和Bcl-2的蛋白表达。结果成瘾SD大鼠脑组织HE染色和Hoechst33342荧光染色显示,与Control组相比,Model组大鼠脑组织出现明显筛网状改变,凋亡细胞数目明显增加;Western blot结果显示,Model组中NEFL、Bax蛋白表达升高,NRN1、Bcl-2蛋白表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05);在二乙酰吗啡干预原代小脑颗粒细胞后,与Control组相比,Model组的细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,NEFL和Bax蛋白表达显著升高,NRN1和Bcl-2蛋白表达显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与Model组相比,sh-NEFL+M组细胞活力显著升高,凋亡率显著降低,NEFL、Bax蛋白表达降低,NRN1、Bcl-2蛋白表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论NEFL、NRN1在二乙酰吗啡致小脑颗粒细胞凋亡中发挥重要作用,降低NEFL表达可减少二乙酰吗啡致小脑颗粒细胞凋亡。

HK2和VDAC1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用

目的探讨HK2和VDAC1在二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡中的作用。方法采用剂量递增方法,建立二乙酰吗啡成瘾大鼠模型。将40只SD大鼠随机分为3组,正常组(Control,n=10)皮下注射等量生理盐水;模型组(Model,n=15)首次皮下注射二乙酰吗啡剂量为5 mg/kg,以后逐日递增剂量2.5 mg/(kg·d),连续注射20 d;模型+10 D组(Model+10D,n=15)在模型组基础上继续递增剂量至第10天。采用ELISA法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷草转氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,GOT)含量;采用HE染色观察各组心肌组织病理变化;采用TUNEL染色检测各组心肌组织细胞凋亡;采用免疫组化、RT-qPCR和Western blot检测HK2、VDAC1及凋亡相关因子的mRNA和蛋白的表达变化。结果HE染色发现随着二乙酰吗啡干预时间的延长,心肌组织表现出不同程度的损伤。与正常组相比,模型组中血清LDH、GOT含量及心肌凋亡率升高,HK2和抗凋亡因子Bcl-2的mRNA和蛋白水平下降,VDAC1和促凋亡因子Bax、Caspase-3的mRNA和蛋白水平升高,Clevead Caspase-3蛋白水平升高;与正常组相比,模型+10 D组中以上指标,差异有统计学意义(P<0.05)。结论二乙酰吗啡可导致心肌细胞凋亡,HK2和VDAC1可能参与了二乙酰吗啡致心肌细胞凋亡的过程。

二乙酰吗啡致大鼠小脑颗粒神经元细胞凋亡过程中C-Jun、Cytc和Caspase-9的作用

背景:二乙酰吗啡药物可导致神经元损伤,但是目前二乙酰吗啡是否诱导神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9因子是否参与此过程尚未见报道。目的:探讨C-jun、Cytc、Caspase-9是否参与二乙酰吗啡诱导神经元细胞凋亡过程。方法:将SD乳鼠小脑颗粒神经元细胞体外培养7 d,采用不同质量浓度二乙酰吗啡(0,10,40,80,100,120 mg/L)干预神经元细胞24 h,在倒置荧光显微镜下观察神经元细胞形态改变,流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用100 mg/L二乙酰吗啡和20μmol/L JNK抑制剂SP600125作用于细胞24 h,通过免疫荧光和蛋白印迹方法检测C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白的表达。结果与结论:①在不同质量浓度二乙酰吗啡干预下,随着给药质量浓度的增加,神经元细胞胞体萎缩、亮度降低,部分呈灰黑色,细胞碎裂,神经元网状结构不同程度的消失,细胞改变数量逐渐增加;②随着给药质量浓度的增加,形态改变的细胞数量明显增多(P <0.01),细胞凋亡率也显著增高(P <0.01);③与对照组相比,100 mg/L二乙酰吗啡作用神经元细胞时,二乙酰吗啡组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白呈高表达,差异有显著性意义(P <0.05);与二乙酰吗啡组相比,二乙酰吗啡+SP600125组C-jun、Cytc和Caspase-9蛋白表达明显下调,差异有显著性意义(P <0.05);④结果表明,二乙酰吗啡可诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡,C-jun、Cytc和Caspase-9参与了二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡的过程。

小脑颗粒神经元细胞凋亡中caspase-8基因变化与二乙酰吗啡的影响

背景:半胱-天冬氨酸蛋白酶8(Caspase-8)是细胞凋亡过程起始的重要因子,二乙酰吗啡可致神经元细胞凋亡,其与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡之间关系尚未见报道。目的:验证二乙酰吗啡诱导小脑颗粒神经元细胞凋亡与caspase-8基因表达情况,明确caspase-8参与二乙酰吗啡致神经元凋亡过程。方法:取出生7 d SD大鼠小脑颗粒神经元细胞进行体外培养,第7天后,以不同质量浓度的二乙酰吗啡(10,40,80,100,120 mg/L)和C-jun氨基末端激酶通路特异性抑制剂SP600125作用小脑颗粒神经元细胞24 h,并分对照组(0 mg/L二乙酰吗啡),80 mg/L二乙酰吗啡组,二乙酰吗啡+SP 600125组;采用Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学改变,流式细胞仪测细胞凋亡率,免疫荧光、RT-PCR及Western Blotting检测caspase-8 mR NA和蛋白表达情况。结果与结论:1施加不同质量浓度二乙酰吗啡致神经元细胞凋亡,凋亡细胞出现透亮深蓝色的凋亡小体,细胞核呈现固缩、凝聚及断裂,随给药浓度增加细胞凋亡率呈现升高趋势(P<0.05)。2与对照组相比,在80 mg/L二乙酰吗啡干预时caspase-8 mR NA和蛋白表达明显明显表达(P<0.05);caspase-8 m RNA随给药浓度增加呈现升高趋势(P<0.05),二乙酰吗啡+SP600125组中caspase-8 m RNA和蛋白较80 mg/L二乙酰吗啡组明显下调(P<0.05)。结果提示caspase-8参与二乙酰吗啡致小脑颗粒神经元细胞凋亡过程,同时也是C-jun氨基末端激酶信号通路中的重要候选促凋亡因子。

二乙酰吗啡干预下大鼠心肌细胞蛋白质组学差异性研究

目的观察二乙酰吗啡干预下大鼠心肌细胞差异蛋白质组学的表达情况。方法SPF级SD大鼠乳鼠60只,提取心脏组织,体外培养原代心肌细胞,分正常对照组(Con)与药物干预组(Drug),Drug组使用10-4mol/L的二乙酰吗啡,Con组使用等量PBS作用24 h,提取2组心肌细胞中的总蛋白采用TMT定量蛋白质组学技术进行分析。结果蛋白质组学研究结果显示,大鼠心肌细胞中共鉴定出5884个蛋白质。2组总差异蛋白质784个,其中上调差异表达蛋白质442个,下调差异表达蛋白质342个。基因本体(GO)功能富集分析结果显示,差异表达蛋白质介导细胞生长过程、代谢过程、生物调节过程及对刺激的反应等重要生物学过程;基因百科全书(KEGG)通路富集分析显示,差异蛋白质集中于心肌收缩通路、钙信号通路、心肌细胞的肾上腺素能信号转导通路、致心律失常性右室心肌病及氧化磷酸化通路等。同时,差异蛋白质与心肌收缩密切相关,包括细胞膜二氢吡啶受体(DHPR)、肌浆网兰诺定受体2(RyR2)、三联蛋白Triadin(TRDN)、肌集钙蛋白2(CASQ2)以及肌钙蛋白I(TnI)等。结论二乙酰吗啡干预下大鼠心肌细胞差异蛋白质组学改变可能与心肌收缩节律异常、心肌细胞能量代谢及功能障碍等密切相关,以上差异蛋白的研究有望为临床上吸食二乙酰吗啡导致的心血管损伤提供新的理论参考和治疗靶点。

二乙酰吗啡干预离体乳鼠心肌细胞动作电位和钙离子电流的变化

背景:阿片类药物可调控心肌细胞膜电位和Ca^(2+)电流的变化,但是目前二乙酰吗啡是否诱导心肌节律、细胞动作电位和钙离子电流改变尚未见报道。目的:探讨二乙酰吗啡对离体SD乳鼠心肌细胞动作电位和钙离子电流的影响。方法:(1)体外培养SD乳鼠心肌细胞,采用5个浓度二乙酰吗啡(0,10^(-2),10^(-3),10^(-4),10^(-5)mol/L)和20 mol/L维拉帕米作用于心肌细胞;(2)将细胞分为对照组、二乙酰吗啡组、二乙酰吗啡+维拉帕米组。后2组分别以二乙酰吗啡、二乙酰吗啡+维拉帕米(浓度20μmol/L)联合干预心肌细胞;对照组加入等量PBS。实验于2018-05-21经新疆医科大学第一附属医院动物实验医学伦理委员会批准,批准号IACUC201805-K1。结果与结论:(1)当不同浓度二乙酰吗啡干预心肌细胞24 h后,心肌细胞形态异常数量亦随其浓度的改变而明显增加,呈剂量依赖性改变。当二乙酰吗啡浓度逐渐升高,细胞存活数量亦逐渐减少,细胞胞质体积缩小,胞膜收缩,伪足减少,细胞核结构模糊。(2)与对照组相比,当加入二乙酰吗啡干预心肌细胞后,心肌细胞自发性搏动频率和节律差异有显著性意义。静息膜电位负值降低,动作电位中动作电位时程显著增加,动作电位幅度显著减小。(3)与对照组相比,二乙酰吗啡组中心肌膜电位改变数量明显增加,当加入维拉帕米后,心肌膜电位改变细胞数量有所降低。与对照组相比,心肌膜电位改变细胞数量有所升高。(4)提示二乙酰吗啡可致离体SD乳鼠心肌细胞形态异常,心肌自发性搏动频率和节律显著增加,心肌细胞膜电位和动作电位发生改变,钙通道阻滞剂维拉帕米对二乙酰吗啡引起的心肌细胞节律异常有一定改善作用。

尿中O6-乙酰吗啡的膜式固相萃取及GC/MS/SIM测定

建立尿中O6-乙酰吗啡的膜式固相萃取(disk SPE)以及GC/MS/SIM定量测定的方法.用SPEC.C18AR/MP3固相萃取柱萃取,以含2%(v/v)氨水的氯仿:丙醇(4:1)为洗脱液,对尿中的O6-乙酰吗啡进行提取.经BSTFA衍生化后再用GC/MS/SIM测定,O6-乙酰吗啡检出限可达0.004μg/mL;同一根萃取柱连续使用7次,没有出现堵塞和污染,回收率及RSD未见下降;用所建立的diskSPE方法对嫌疑尿样进行分析,与液-液萃取的结论一致.该方法适合于法医毒物分析.

使用二乙酰吗啡者肝脏功能的检测和分析

本文对９２名使用二乙酰吗啡者肝脏功能生化指标进行测定和分析。其中７４例出现生化指标的改变，特别是反映肝脏功能的ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＡＬＰ、ＧＧＴ四种特异性指标，并且ＡＬＴｆｏＡＳＴ的变化有密切相关性。使用二乙酞吗啡时间越长，这些特异性指标的变化也越大。与本市正常人群调查对照。结果表明二乙酰吗啡可以引起肝脏功能的异常。

二乙酰吗啡致大鼠心律失常类型及膜电位变化对心律失常的影响

目的研究二乙酰吗啡致大鼠心律失常类型及膜电位变化对心律失常的影响。方法采用二乙酰吗啡剂量递增法,实验组大鼠为Wistar大鼠,二乙酰吗啡使用量从5 mg/kg开始,每日3次,以后每日递增2.5 mg/kg,观察盐酸纳洛酮催瘾后的戒断症状,判断二乙酰吗啡致大鼠成瘾是否成功建立。实验组大鼠成瘾后继续增加二乙酰吗啡使用量,进一步建立实验组大鼠的心律失常模型,直至实验组大鼠死亡,分析大鼠死亡前心律失常的类型;对心律失常大鼠采用膜片钳技术检测膜电位变化。结果二乙酰吗啡致大鼠出现各种心电图变化及各种心律失常类型,心肌细胞动作电位时程中APD90显著缩短(P<0.05)。结论二乙酰吗啡致大鼠心肌细胞膜电位的改变为心律失常的发生原因之一,成瘾后的大鼠死亡的心律失常类型为临床治疗及法医学检案提供理论依据。

CASQ2和RyR2在二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常中的作用

目的探讨二乙酰吗啡致心肌细胞节律改变与心肌钙离子通道异常之间的关系,探究肌钙集蛋白2(CASQ2)与兰碱尼受体2(RYR2)因子与钙通道之间的联系,明确其是否参与心肌细胞钙离子通道异常及心律失常的过程。方法取出生3日龄SD大鼠乳鼠的心肌细胞进行体外培养,分为正常对照组(N组)、二乙酰吗啡干预组(H组)、二乙酰吗啡加维拉帕米干预组(H+V组),二乙酰吗啡浓度为10^(-4) mol/L,药物作用时间24 h。在荧光倒置显微镜下,观察心肌细胞形态和收缩频率节律改变;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测CASQ2和RyR2因子的mRNA及蛋白表达,观察H组、N组及H+V组上述2个因子表达含量的变化情况。结果 (1)细胞培养:原代心肌细胞形态多样,呈三角形、长梭形和多边形,细胞核圆形或类圆形,大小正常核膜光滑,细胞间通过伪足相互连接,连接成片的细胞搏动节律一致。(2)心肌细胞形态及节律改变:与N组相比,H组和H+V组心肌细胞形态发生一定程度的改变,收缩频率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与N组相比,H组和H+V组中CASQ2和RYR2蛋白和mRNA表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。与H组相比,H+V组中CASQ2和RYR2蛋白和mRNA表达量减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论二乙酰吗啡可致心肌细胞自发性搏动频率和节律异常,CASQ2和RyR2因子参与二乙酰吗啡致心肌细胞自发性搏动频率和节律异常的过程。关键字:

二乙酰吗啡成瘾及神经毒性作用机制研究进展

二乙酰吗啡(diacetylmorphine,DAM)是一种具有极强依赖性的中枢性兴奋剂,长期滥用会产生严重的神经毒性症状。DAM是我国滥用人数最多的毒品,已成为危害社会稳定的严重公共卫生问题。DAM可以诱导神经细胞发生凋亡,对人体健康产生极大的影响。本文对DAM成瘾和戒断机制以及对神经因子的影响作一综述,为DAM对神经细胞毒性作用机制研究提供理论依据。

抑制剂KN-93干预二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常的蛋白质组学分析

目的使用蛋白质组学分析抑制剂KN-93干预二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常的作用。方法60只SPF级SD大鼠乳鼠,雌雄不限,提取心肌组织,体外培养SD大鼠乳鼠原代心肌细胞,分为对照组和实验组,对照组使用100μmol/L二乙酰吗啡作用24 h,实验组使用100μmol/L二乙酰吗啡+1μmol/L KN-93作用24 h。采用TMT相对定量蛋白质技术筛选出对照组和实验组之间具有显著性表达差异蛋白质,筛选标准:表达倍数上调>1.2倍或下调<0.83倍且P<0.05。通过GO功能富集分析差异表达蛋白质的主要功能、细胞定位和参与的生物学过程,通过KEGG通路富集分析差异表达蛋白质可能参与的代谢或信号通路,通过蛋白质相互作用网络分析蛋白质之间有结合作用或相互作用。结果与对照组比较,实验组Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)磷酸化水平降低,差异有统计学意义(P<0.05);TMT技术共筛选出346个差异表达蛋白质,主要参与对细胞因子的反应、细胞对细胞因子刺激的反应等过程,影响相同的蛋白质结合、信号受体结合等分子功能和细胞外区域部分、胞外区等细胞组分蛋白,主要富集在癌症途径、PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、阿尔茨海默病等信号通路。蛋白互作网络显示,MSH6、NFk B1等可能与CaMKⅡ存在蛋白质互相作用关系。与对照组比较,实验组ADCY7、NFk B1、MSH6、MMP2、MMP9、NQO1、TXNRD1蛋白表达显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论CaMKⅡ可能通过调控NFk B、MSH6等蛋白的改变,通过癌症途径信号通路调节心肌细胞凋亡,参与二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常过程。

二乙酰吗啡盐酸盐标准物质的研制(2)——定值和不确定度评定

目的对研制的二乙酰吗啡盐酸盐标准物质进行定值,并评定定值结果的不确定度。方法采用定量核磁共振法和质量平衡法进行定值;采用液质联用法用于有机物杂质的定性分析,采用电感耦合等离子质谱法、离子色谱法、顶空-气质联用法和卡尔费休滴定法测定无机阳离子、阴离子、挥发性有机溶剂残留和水分等杂质的含量。结果定量核磁共振法的纯度为95.6%,不确定度为0.13%;质量平衡法的纯度为95.3%,不确定度为0.93%。结论二乙酰吗啡盐酸盐标准物质的纯度值为95.6%,扩展不确定度为1.2%(k=2)。

二乙酰吗啡盐酸盐标准物质的研制(1)—均匀性和稳定性检验

目的研制二乙酰吗啡盐酸盐标准物质,并检验其均匀性和稳定性。方法采用中压快速纯化制备系统分离纯化海洛因样品得到二乙酰吗啡盐酸盐,确认其结构后,采用统计学方法进行均匀性检验和稳定性检验。结果二乙酰吗啡盐酸盐标准物质含有0.88个结晶水,其瓶间不均匀性产生的标准不确定度为0.29%,短期和长期稳定性的标准不确定度分别为0.04%和0.46%。结论研制的二乙酰吗啡盐酸盐标准物质均匀性和稳定性良好。

二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常中κ受体影响LDH、AST表达的作用

目的:探究κ受体在二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常中的作用机制。方法:取出生3天SD大鼠乳鼠心肌细胞体外培养7天后,用二乙酰吗啡和选择性κ受体阻断剂作用心肌细胞30min,检测乳酸脱氢酶(LDH)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)。结果:与对照组相比,在二乙酰吗啡干预下(H组)LDH和AST明显升高,H+B组中LDH和AST值较H组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:κ受体参与二乙酰吗啡致心肌节律异常,同时也是影响心肌细胞释放LDH和AST的因素。

等比重0.5%布比卡因脊髓麻醉时加与不加二乙酰吗啡的效应

60例患者随机、双盲分为两组,每组30例。一组为下肢血管及腹股沟手术;另一组为经尿道的泌尿生殖系手术。每组又分为单用0.5%布比卡因4ml 混合液组,在腰椎间隙穿刺。术后27h 内,观察止痛效应及副作用。

二乙酰吗啡致右心感染性心内膜炎临床分析

二乙酰吗啡致右心感染性心内膜炎（ＲＨＩＥ）４例，急性起病，以多发性肺脓肿为主要临床特征。血培养金黄色葡萄球菌３例，白色葡萄球菌１例，超声检查三尖辨均有赘生物存在。提示及时诊断可避免延误治疗。

纳洛酮治疗急性二乙酰吗啡中毒16例报告

纳洛酮治疗急性二乙酰吗啡中毒１６例报告广州市第二人民医院急诊科（５１０１５０）邝莉萍二乙酰吗啡进入体内后很快被分解为乙酰吗啡，作用于吗啡受体，对大脑皮质有抑制作用，对丘脑呼吸中枢有强大的选择性抑制作用；剂量过大时还能引起体内组织胺的释放，抑制血管运动...

二乙酰吗啡对BV-2细胞损伤作用机制研究

目的 探索二乙酰吗啡(DAM)对神经胶质细胞(BV-2)损伤作用机制。方法 选用具有分裂增殖能力的神经胶质细胞(BV-2)为实验对象,分别给予30、60、120 mg/L DAM,孵育4、8、16、32和48 h,用台盼蓝、噻唑蓝(MTT)法检测DAM对BV-2细胞损伤程度和增殖抑制率,用流式细胞仪检测DAM对BV-2细胞周期和细胞凋亡的影响,用ELISA法检测BV-2细胞BDNF、HSP-70、Bax、caspase-9、c-Fos、TrkB蛋白水平。结果 台盼蓝、MTT检测显示,死亡细胞依DAM浓度增加和作用时间的延长显著增多,BV-2细胞增殖抑制率比对照组显著升高。流式细胞仪检测显示,DAM组G0/G1期细胞数比对照组明显增加,G2期细胞数显著减少,凋亡率增加。ELISA法检测显示,DAM组Bax、caspase-9、c-Fos蛋白水平比对照组显著升高,HSP-70、BDNF、TrkB蛋白水平比对照组明显降低。结论 DAM对BV-2细胞损伤作用机制与上调损伤蛋白水平、下调保护蛋白水平、损伤细胞膜结构、抑制细胞分裂、导致细胞凋亡、死亡有关。

~1H qNMR定量测定二乙酰吗啡对照品的含量

目的:建立二乙酰吗啡含量的~1H定量核磁共振(~1H qNMR)测定方法。方法:以对苯二甲酸二甲酯基准试剂为内标,以氘代氯仿为溶剂,采用Bruker AvanceⅢ600型核磁共振谱仪,noesyigld1d脉冲序列在恒温25℃下获取~1H NMR谱,测定二乙酰吗啡的含量,驰豫延迟时间为25 s。结果:以二乙酰吗啡的峰(δ6.76)及对苯二甲酸二甲酯(δ8.10)峰作为定量峰,测得精密度RSD(n=5)为0.22%,重复性RSD(n=5)为0.43%。~1H qNMR测得二乙酰吗啡的含量为98.7%,与质量平衡法结果 98.7%(HPLC)、98.3%(GC)以及DSC法结果 98.4%基本一致。结论:建立的~1H qNMR可测定二乙酰吗啡的含量。此方法准确快捷,简单易行,是对标准物质含量测定的一种良好的补充方法。