人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶重组蛋白的构建、纯化及酶活性研究

目的构建人细胞内Ⅰ型血小板激活因子乙酰水解酶(PAF-AH)重组蛋白并加以纯化,利用不同底物研究酶活性。方法细胞内Ⅰ型PAF-AHβ亚基基因进行PCR扩增,目的基因经纯化、连接载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞构建重组蛋白,提取质粒行琼脂糖凝胶电泳、NdeⅠ和HindⅢ双酶切及测序鉴定。鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞诱导蛋白表达和纯化,15%SDS-PAGE和Western blotting鉴定。分别以乙酸苯酯、l-O-hexadecyl-2-deoxy-2-thioacetyl-sn-glycero-3-phosphocholine(2-Thio PAF)和1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidylcholine为底物(后两者为血浆型PAF-AH的商业化底物),应用分光光度法检测纯化后重组蛋白的酶活性,以血浆型PAF-AH作为阳性对照。结果人细胞内PAF-AHⅠ型β亚基重组蛋白构建正确,纯化后在大肠杆菌感受态细胞中诱导表达。与阳性对照血浆型PAF-AH比较,纯化后的重组蛋白同样能够水解乙酸苯酯,具有芳香酯酶活性;能快速水解2-Thio PAF,但不能水解1-myristoyl-2-(4-nitrophenylsuccinyl)phosphatidyl-choline。结论成功构建人细胞内Ⅰ型PAF-AH重组蛋白,其对血浆型PAF-AH的两个商业化底物具有完全不同的水解能力,以此可快速区分细胞内和血浆型PAF-AH。

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与脑动脉粥样硬化性狭窄的关联性研究

目的研究血小板活化因子乙酰水解酶(platelet-activating factor acetylhydrolase,PAF-AH)基因Arg92His(4,275;G→A)、Ile198Thr(7,593;T→C)、Val279Phe(9,994;G→T)突变与脑动脉粥样硬化性狭窄(cerebral artery atherosclerotic stenosis,CAAS)及狭窄颅内外分布的关系。方法 642例行全脑血管数字减影造影(cerebral digital subtraction angiography,DSA)检查的患者,根据狭窄程度,分为脑动脉狭窄(CAAS)组477例和对照组156例,CAAS组进一步分为3个亚组,单纯颅内动脉狭窄(intracranial atherosclerotic stenosis,ICAS)组,单纯颅外动脉狭窄(extracranial artery atherosclerotic stenosis,ECAS)组,颅内外动脉联合狭窄(intracranial-extracranial artery atherosclerotic stenosis,IECAS)组。比较Arg92His、Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率在各组的分布。结果 Arg92His突变基因型及等位基因频率,在ICAS组显著高于对照组(42.6%vs.30.3%;23.3%vs.16.4%)(P<0.05),而ECAS组、IECAS组突变基因型频率(28.7%,26.1%)及突变等位基因频率(17.0%,15.3%)与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率在ICAS组、ECAS组、IECAS组与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。CAAS组与对照组比较,Arg92His、Ile198Thr、Val279Phe突变基因型及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。结论 Arg92His位点突变可能参与了颅内动脉粥样硬化性狭窄的发生。

哮喘患儿血小板活化因子乙酰水解酶活性的研究

目的 探讨哮喘患儿血小板活化因子乙酰水解酶 (PAF AH)活性与病情的关系 ,及其活性与基因型的关系。方法 应用酶水解底物显色法测定不同病情哮喘患儿和健康儿童PAF AH活性。应用等位基因特异性聚合酶链式反应 (AS PCR)技术检测PAF AH基因第 9外显子Val2 79Phe基因型。结果 重度哮喘组血浆PAF AH活性明显低于轻、中度哮喘组和对照组 ,酶活性缺失率重度组占 15.4% ,而轻、中度哮喘组和对照组酶活性缺失率占 2 %～ 3 %。哮喘组及对照组 3种基因型 (Val/Val、Val/Phe和Phe/Phe)血浆PAH AH活性间比较有显著性差异 (P均 <0 .0 1) ,同一种基因型PAH AH活性哮喘组与对照组相比无显著性差异 (P >0 .0 5)。结论 血浆PAF AH活性与哮喘严重程度相关联 ,重度哮喘组酶活性显著低于轻、中度哮喘组和对照组 ;血浆PAF AH活性与PAF AH(Val2 79Phe)

肺炎支原体肺炎婴幼儿不同病期免疫功能、细胞因子、血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性变化

目的探讨婴幼儿肺炎支原体肺炎（MPP）急性期与恢复期免疫功能、细胞因子、血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）基因多态性的动态变化。方法MPP组235例,年龄5个月-3岁;急性期为病程d1-9,恢复期为愈后8-20周。对照组为正常健康儿童90例,6个月-3岁。以酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IgA、IgM、IL-2与IL-2受体（IL-2R）、IL-4、IL-8、干扰素-γ（IFN-γ）;速率散射法测定IgG及其亚群;单相琼脂扩散法测定补体C3、C4;PGE法测定循环免疫复合物（CIC）;APAAP法测定T细胞亚群;特异性聚合酶链式反应（AS-PCR）法与PAF-AH试剂盒测定PAF-AH基因多态性与酶活性。对婴幼儿MPP急性期、恢复期与对照组的结果进行比较分析。结果MPP组急性期IgA、IgM、补体C4、CIC、CD8＋、IL-2R、IL-6、IL-8、INF-γ、INF-γ/IL-4均高于恢复期与对照组（Pa〈0.05）,补体C3、CD3＋、CD4＋、CD4＋/CD8＋、IL-2均低于恢复期与对照组（Pa〈0.05）,IgG及亚群各组间差别无统计学意义（Pa〉0.05）。PAF-AH突变基因型频率、突变等位基因频率、PAF-AH酶活性各组差别无统计学意义（Pa〉0.05）。结论婴幼儿MPP免疫功能变化的主要表现为Th1免疫应答增强,Th2免疫应答减弱,细胞因子改变,但多数免疫学指标及细胞因子恢复较快。婴幼儿MPP发病与PAF-AH基因型无关,但急性期PAF-AH酶活性有下降趋势。

血小板活化因子及其乙酰水解酶在新生儿感染中的变化及临床意义

目的检测感染新生儿血浆血小板活化因子(PAF)水平及其乙酰水解酶(PAF-AH)的活性,探讨两者在新生儿感染中的变化及临床意义。方法以复旦大学附属儿科医院新生儿科病房收治的日龄<30d的新生儿为研究对象。依据感染部位和程度分为全身感染组、局部感染组及非感染组;依据日龄分为早期新生儿(≤7d)和晚期新生儿(>7d)。采集研究对象桡动脉血标本,对全身感染组中合并器官功能衰竭的患儿在感染的第1、3、5和7天增加采集桡动脉血标本。测定血浆PAF水平(μg.L-1)和PAF-AH活性(μmol.L-1.min-1)。分析感染程度、性别、日龄和出生体重对血浆PAF水平和PAF-AH活性的影响,比较不同感染组PAF水平和PAF-AH活性的差异,观察全身感染合并器官功能衰竭患儿血浆PAF水平和PAF-AH活性在病程1～7d的变化趋势。结果研究期间共收治247例新生儿,男146例,女101例;平均日龄9.2(1～57)d;平均胎龄35.85(27～43)周;平均出生体重2517(906～4750)g。全身感染组91例,局部感染组63例,非感染组93例。①新生儿血浆PAF水平与感染程度相关(P=0.000);血浆PAF-AH活性与感染程度及日龄(P均为0.000)相关。②全身感染组血浆PAF水平(9.5±8.1)显著高于局部感染组(5.3±3.2)及非感染组(4.6±3.5)。早期新生儿中,全身感染组血浆PAF-AH活性(5.7±2.7)显著低于局部感染组(7.3±2.9)和非感染组(7.3±2.5)。晚期新生儿中,全身感染组血浆PAF-AH活性(7.0±2.5)显著低于局部感染组(9.7±2.2)和非感染组(9.7±2.7)。③全身感染组合并器官功能衰竭的9/12例存活患儿在病程的1～7d血浆PAF水平呈下降趋势,PAF-AH活性呈上升趋势。3/12例死亡患儿中两者的变化趋势则相反。④全身感染组31/91例确诊败血症患儿中,革兰阴性菌感染者血浆PAF水平(13.1±11.0)显著高于革兰阳性菌感染者(5.4±3.9),PAF-AH活性(4.9±2.1)显著低于革兰阳性菌感染者(7.9±2.4)。结论新生儿严重感染时血浆PAF水平增高,PAF-AH活性降低,两者的变化趋势与预后相关。

银屑病患者血浆血小板活化因子乙酰水解酶活性变化及其临床意义

目的 探讨银屑病患者血浆血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)活性变化在银屑病发病机制中的作用。方法 采用酶水解底物显色法测定银屑病患者血浆PAF-AH活性。结果 银屑病患者血浆PAF-AH活性明显低于健康对照者(P<0.01)。进展期银屑病患者的血浆PHF-AH活性明显低于静止期和退行期患者(P<0.01),静止期组和退行期组的差异不具有显著性(P>0.1)。结论 PAF-AH活性不足可能是银屑病发病的重要内源性因素之一,其活性水平与银屑病的病情活动性具有相关性,在进行病情及预后判断时可能具有一定的参考意义。

原发性痛经患者瘀血舌象与血小板活化因子及血小板活化因子乙酰水解酶关系

目的探讨原发性痛经患者瘀血舌象形成的病理机制。方法 随机选择原发性痛经患者41例和健康人20名,采用ELISA法检测血小板活化因子(PAF)和血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)水平。结果 原发性痛经瘀血舌组(22例)PAF值水平(ng/L)(252.214±37.568)高于非瘀血舌组(212.348±22.794,19例)及健康对照组(182.126±18.306),而PAF-AH值相反[依次分别为(μg/L)3.090±1.483,5.382±1.873,5.607±2.073,P<0.05];非瘀血舌组仅PAF高于健康对照组(P<0.05)。瘀血舌3个中医证型间PAF和PAF-AH比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 原发性痛经瘀血舌象患者外周血中PAF活性明显增高,PAF-AH活性明显降低,PAF-AH与PAF的失衡与原发性痛经瘀血舌象患者发病机制有关。

钩端螺旋体血小板激活因子乙酰水解酶基因特征分析

目的 由于钩端螺旋体病的主要特征之一是组织器官广泛性出血 ,出血部位发生在黏膜、脏器、浆膜和皮肤等处 ,严重者出现大面积肺弥散性出血、咳血 ,是危重钩端螺旋体病早期最常见的死因 ,其致病机理仍不清楚。本文使用生物信息学软件分析钩端螺旋体基因LA2 14 4 (血小板激活因子乙酰化酶 ,PafAH)所编码蛋白的结构和功能 ,并探讨其在致病过程中的作用。方法 使用NCBI ,Swissprot/TrEMBL ,ProDom ,Pfam ,Jpred2 ,SWISS -MODEL ,TMpred ,SignalP ,ClustW对问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株全基因组ORF基因诠释 ,编码蛋白进行在线分析 ,并使用Bioedit软件进行氨基酸同源性比较分析。结果 确定了问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株血小板激活因子乙酰化酶基因 ,该基因编码蛋白质与哺乳动物 pafAH在一级结构上相似性达 4 2 % ,以牛脑 pafAH(Ib)γ亚基 (1WAB/PDB)为模件模拟该蛋白三级结构 ,发现两者立体结构与非常相似 ,催化位点完全相同 ,均由Ser-His-Asp组成催化三合体。结论 该基因可能与钩体染色体所编码的胶原酶基因 ,溶菌酶基因 ,YopM基因 ,VwA基因协同在钩端螺旋体病出血过程中起作用 。

脑出血与血浆血小板激活因子乙酰水解酶基因G994T突变的相关研究

目的探讨血浆血小板激活因子乙酰水解酶pPAF-AH基因G994T突变与中国人群脑出血发病的相关关系。方法利用等位基因特异性聚合酶链反应技术分析了150例原发性脑出血病人和150例非脑血管病对照组pPAF-AH基因的基因型位点频率。结果T等位基因在脑出血组的频率是3%,在对照组是4%,GT杂合子在脑出血组和对照组频率分别为6.8%和8.5%,两组差异无显著意义。没有发现突变型的纯合子。结论pPAF-AH基因G994T突变与中国人群的脑出血没有明显的相关关系。

血小板活化因子乙酰水解酶融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的:获得血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)全长编码基因并在GST原核表达系统中表达。方法:通过RT- PCR方法,从正常人外周血单个核细胞(PBMC)中扩增出PAF-AH全长编码基因,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T- 3,转化大肠杆菌BL21并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化。所得纯化蛋白以SDS-PAGE及Western印迹方法鉴定,并进行酶活性测定。结果:获得了PAF-AH基因,序列分析与GenBank数据库中序列一致。SDS-PAGE及Westem印迹结果显示,诱导表达出可溶性的融合蛋白,其相对分子质量与预期相符。纯化蛋白经Western印迹检测能够被特异性抗体所识别,具有免疫学活性;酶活性检测证实其具有特异的水解PAF的活性。结论:本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的PAF-AH蛋白。

血小板活化因子及其乙酰水解酶与儿童紫癜性肾炎的关系

目的探讨血小板活化因子(PAF)及其乙酰水解酶(PAF-AH)与儿童紫癜性肾炎(HSPN)的关系。方法收集2015年10月至2016年3月我院儿科初诊为过敏性紫癜患儿60例作为病例组,分为HSPN组和非HSPN组,体检健康儿童20例作为对照组。采用实时荧光定量PCR技术检测PAF及PAF-AH mRNA的表达,同时采用酶联免疫吸附法检测血清中PAF及PAF-AH蛋白水平变化。结果 (1)HSPN组患儿PAF及PAF-AH mRNA表达较非紫癜性肾炎及对照组增高(P<0.01);非HSPN组患儿PAF及PAF-AH mRNA表达较对照组增高(P<0.01);(2)HSPN组患儿PAF及PAF-AH蛋白表达较非HAPN及对照组增高(P<0.01);非HSPN组患儿PAF及PAF-AH蛋白表达较对照组患儿高(P<0.01)。结论 PAF及PAF-AH可能参与紫癜性肾炎的发病过程。

血浆血小板活化因子乙酰水解酶的活性及其与中国人群冠状动脉疾病的关系

目的研究血浆血小板活化因子(PAF)乙酰水解酶(PAF-AH)的活性及其与中国人群冠状动脉疾病(CAD)的关系。方法检测918例CAD患者PAF-AH的活性、脂类的活性以及筛选基因多态性PTAFR基因。结果①病例组和对照组之间性别校正后PAF-AH的平均活性:无CAD者,女性比男性具有明显的PAF-AH低活性。病例组高血压者的PAF-AH活性比非高血压者明显降低。②PAF-AH在所有分组与低密度脂蛋白(LDL)和总胆固醇(TC)以及apoB-100活性有很强的相关性。③整体来看,PAF-AH的活性与CAD呈现相关性(P<0.05)。④PTAFR基因多态性在CAD患者和对照组的基因型没有显著差异。结论血浆PAF-AH活性存在性别差异,并且与CAD呈现正相关,然而,PAF-AH活性和炎症标志物没有相关性。

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与黎族支气管哮喘相关作用的研究

目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因多态性与黎族支气管哮喘之间的关系。方法采用等位基因特异性聚合酶链式反应技术等方法,检测108例黎族支气管哮喘患者及115例健康黎族人PAF-AH基因第9外显子Val279Phe基因多态性和酶活性。结果(1)哮喘组与对照组研究对象血浆PAF-AH突变基因型频率、突变等位基因频率间差别均无显著性意义(P>0.05);(2)哮喘缓解组与对照组研究对象血浆PAF-AH活性间差别无显著性意义(P>0.05),二者均高于哮喘发作组(P<0.001);(3)不论是在对照组,还是在哮喘缓解组,Val/Val基因型和Val/Phe基因型血浆PAF-AH活性间差别均有显著性意义(P<0.01),而两组研究对象在同一基因型中血浆PAF-AH活性间差别均无显著性意义(P>0.05)。结论海南黎族哮喘与PAF-AH基因型无关,但其哮喘所处状态与PAF-AH活性有关。

细胞型血小板活化因子乙酰水解酶Ⅱ活力与急性脑梗死的关系

目的研究细胞型血小板活化因子乙酰水解酶Ⅱ（PAF-AHⅡ）活力与急性脑梗死的关系。方法采用PAF-AHⅡ活力检测试剂盒检测120例不同病程、梗死面积及病情的急性脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力,并与健康对照组比较。结果脑梗死组病程1d、2-3d、4-7dPAF-AHⅡ活力明显高于健康对照组（均P〈0.01）,病程8-14d与健康对照组差异无统计学意义（均P〉0.05）;病程1d、2-3d、4-7d大面积脑梗死组的PAF-AHⅡ活力比中、小面积脑梗死组明显增高（均P〈0.05）,病程8~14d两组间差异无统计学意义（均P〉0.05）;病程≤7d脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力与病情严重程度呈正相关（r=0.31,P〈0.05）,病程8-14d脑梗死患者的PAF-AHⅡ活力与病情严重程度无相关性（P〉0.05）。结论PAF-AHⅡ活力与急性脑梗死的发生、发展有密切关系,并对判断脑梗死的严重程度有一定意义。

重组人血小板活化因子乙酰水解酶保护小鼠脑缺血再灌注的研究

目的观察重组人血小板活化因子乙酰水解酶(rPAF-AH)对小鼠脑缺血再灌注的保护作用。方法采用线栓法建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,尾静脉注射rPAF-AH预处理后观测模型小鼠神经行为学和脑梗死灶大小的改变,采用Westernblot研究MMP-2的表达及活性,同时与奥扎格雷钠注射液、金纳多注射液及假手术对照组比较。结果 rPAF-AH预处理明显降低脑梗死小鼠行为障碍的神经行为学评分和脑梗死灶的大小(P<0.01)。Westernblot分析结果证明,rPAF-AH预处理可降低脑缺血再灌注损伤所诱导的MMP-2蛋白的表达及其活性水平(P<0.01)。结论 rPAF-AH预处理对小鼠脑缺血再灌注损伤有一定的保护作用,这可能得益于其抑制了MMP-2蛋白的高表达及活性增高。

血小板活化因子乙酰水解酶基因Ile198Thr突变与银屑病的相关研究

目的:探讨血小板活化因子乙酰水解酶基因(Ile198Thr)突变与银屑病的关系。方法:对50例银屑病患者及50例健康对照者,分别用聚合酶链反应技术(PCR)及测序分析基因组DNA的突变等位基因。结果:银屑病组突变率与对照组无显著差异(P>0.05)。结论:血小板活化因子乙酰水解酶基因(Ile198Thr)突变与银屑病无相关性,其突变可能与银屑病的发病无关。

血小板活化因子乙酰水解酶基因多态性与支气管哮喘的相关性

目的研究血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)基因多态性与支气管哮喘儿童发病的关系。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析技术,对53例哮喘及35例正常对照组儿童PAF-AH第11外显子Ala379Val位点基因多态性进行分析。结果哮喘组患儿基因组型频率和等位基因频率与对照组比较均无显著性差异(P均>0.05)。结论PAF-AH第11外显子Ala379Val基因突变与儿童支气管哮喘发病无关。

早期妊娠妇女血浆中血小板活化因子含量和血小板活化因子-乙酰水解酶活性的变化及意义

目的:探讨早期妊娠妇女血浆中血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)的含量、血小板活化因子-乙酰水解酶(PAF-acetyl-hydrolase,PAF-AH)的活性变化及意义。方法:通过病史询问、妇科检查及B超确定早孕。采用生物法检测120例早期妊娠妇女和20例正常非孕妇女血浆中的PAF含量,同时采用酶水解底物显色法测定血浆中的PAF-AH活性,放射免疫法检测血清中的hCG-β。结果:早期妊娠妇女血浆中PAF含量为(12.5±4.3)ng/mL,正常非孕妇女为(6.7±2.8)ng/mL,两组比较差异有显著性(P<0.01);早期妊娠妇女血浆中PAF-AH活性为(17±1.1)nmol/(min·mL),正常非孕妇女为(32±1.8)nmol/(min·mL),两组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:早期妊娠妇女血浆中PAF含量和PAF-AH活性的变化在妊娠的发生和发展中起着较为重要的作用。

血小板活化因子乙酰水解酶与过敏性紫癜肾脏损害的相关性研究

目的:研究过敏性紫癜(HSP)患者血小板活化因子乙酰水解酶(PAF-AH)与肾脏损害的关系。方法:临床纳入81例我院2016年10月～2017年10月期间收治的HSP患者作为研究对象。按有无肾脏损伤分为紫癜性肾炎(HSPN)组(n=36)与非HSPN组(n=45)。另选取40例同期来我院体检的健康志愿者作为对照组。结果:HSPN组PAF-AH mRNA、PAF-AH蛋白、VEGF以及HSP70水平明显高于非HSPN和对照组,P <0. 05;非HSPN组PAF-AH蛋白、VEGF以及HSP70水平明显高于对照组,P <0. 05;但非HSPN组PAF-AH mRNA与对照组无差异,P> 0. 05。HSPN患者PAF-AH水平随着VEGF、HSP70水平的升高而升高,均呈正相关,P <0. 05。结论:PAF-AH参与了HSP患者肾脏损伤的过程,且随着肾脏损伤程度的加重,PAF-AH表达水平升高。

血小板活化因子乙酰水解酶基因突变与脑血管病的关系

①目的 探讨血小板活化因子 (PAF)乙酰水解酶基因突变与脑血管病发病的关系。②方法 应用多聚酶链反应 (PCR)技术 ,分析 16 0例脑血管病病人及 10 0例健康对照者的PAF乙酰水解酶基因型及基因组DNA突变等位基因频率 ,并测定血浆PAF乙酰水解酶的活性。③结果 脑梗死组与脑出血组PAF乙酰水解酶突变基因型及突变等位基因的频率显著高于对照组 ,差异有显著性 (χ2 =6 .397～ 9.75 8,P <0 .0 5、0 .0 1) ;伴不同危险因素脑血管病病人基因突变的差异无统计学意义。