乙酰转移酶10通过介导盘状蛋白结构域受体1 mRNA的ac4C乙酰化修饰促进宫颈癌细胞的恶性行为

乙酰转移酶10(N-acetyltransferase 10,NAT10)是mRNA乙酰化修饰的关键酶,通过介导ac4C乙酰化修饰(N4-acetylcytidine,ac4C)调控靶基因的表达并调控多种癌症的生物学功能,但NAT10对宫颈癌(cervical cancer,CC)细胞的调控却少有报道。本研究拟探讨NAT10对宫颈癌细胞恶性行为的影响。首先,通过数据库分析发现NAT10高表达与宫颈癌病人预后不良相关。MTT实验和集落形成结果显示,过表达NAT10增加了宫颈癌细胞的生长活性(P<0.05)和增殖能力(P<0.001);Transwell迁移和侵袭结果表明,过表达NAT10提高了宫颈癌细胞的迁移(P<0.01)和侵袭(P<0.05)能力;Western免疫印迹结果显示,过表达NAT10使间皮细胞标志物波形蛋白(vimentin)上调,使上皮细胞标志物E-钙黏着蛋白(E-cadherin)下降。并且,生物信息学分析显示,盘状蛋白结构域受体1(discoidin domain receptor 1,DDR1)可能是NAT10的下游靶基因,RNA结合蛋白免疫沉淀结果表明,NAT10可以直接结合DDR1的mRNA(P<0.05),Western免疫印迹和RT-qPCR的结果表明,过表达NAT10使DDR1蛋白质水平和mRNA水平明显上调(P<0.05)。此外,RNA乙酰化免疫沉淀结果表明,过表达NAT10增加了DDR1 mRNA的乙酰化水平(P<0.001),并且EGFP报告系统进一步确定了NAT10识别DDR1 mRNA的乙酰化位点。mRNA半衰期的结果显示,NAT10可提高DDR1 mRNA的稳定性(P<0.05)。综上所述,NAT10促进宫颈癌细胞的生长、增殖活性以及迁移侵袭能力,其机制是通过对DDR1 mRNA进行乙酰化修饰延长其mRNA的稳定性,这可能为mRNA乙酰化修饰对宫颈癌发生发展的分子机制提供新的见解。

N-乙酰转移酶10在肿瘤发生发展中作用的研究进展

N-乙酰转移酶10(NAT10)是一种广泛表达于多种组织和细胞中的蛋白质,NAT10的高表达与肿瘤的侵袭、转移、耐药性密切相关。NAT10促进肿瘤发生发展的机制涉及因NAT10表达或定位的改变对细胞周期、mRNA稳定性、翻译效率以及相关通路的调控等,从而影响肿瘤的发生发展及预后。

乙酰转移酶基因NAA10的生物学功能及其在肿瘤中的作用

N端乙酰转移酶A(N-acetyltransferase A,NatA)复合体是真核生物最主要的N端氨基酸α位乙酰转移酶,N端α位乙酰转移酶10基因(N-α-acetyltransferase 10,NAA10)编码的N端α位乙酰转移酶10蛋白(N-α-acetyltransferase 10 protein,Naa10p)是NatA的催化亚基.Naa10p具备新生蛋白质N端氨基酸α位乙酰化活性、成熟蛋白质Lys残基ε位乙酰化活性以及对部分转录因子的协同调节作用.Naa10p能够通过调节细胞周期促进细胞增殖,通过调节雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)通路促进细胞自噬,并通过多种不同的分子信号通路抑制细胞运动能力.根据乙酰化底物的不同,Naa10p还在细胞凋亡的调控中起双重作用.Naa10p参与的生物学过程还涉及血管生成和神经发育等.Naa10p在多种癌症组织中呈过表达,但其预后意义随肿瘤不同而有较大差别.对Naa10p的生理生化研究必将使我们对细胞的生理病理学过程及其机制的了解更加深入全面.本文将从蛋白质结构、机制功能及临床意义等不同角度系统地阐述NAA10的研究现状与进展.

乳腺癌细胞N-乙酰转移酶10高表达诱导铂类药物耐药的作用机制

目的探讨在乳腺癌细胞中高表达的N-乙酰转移酶10(NAT10)引起对铂类抗肿瘤药的耐药效应, 并揭示其潜在机制。方法实验分为野生型组(MCF-7野生型细胞未经任何处理)、NAT10过表达组(h-NAT10质粒转染至MCF-7细胞)和NAT10敲低组(sh-NAT10质粒转染至MCF-7细胞)。采用Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力, 采用免疫共沉淀实验检测NAT10与多聚ADP核糖转移酶1(PARP1)的相互作用, 并检测过表达或敲低NAT10的表达对PARP1乙酰化水平和半衰期的影响, 通过免疫组化染色和免疫沉淀实验检测乙酰化的PARP1招募相关DNA损伤修复相关蛋白的情况, 采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果 Transwell实验显示, NAT10过表达组细胞侵袭数为(483.00±46.90)个, NAT10敲低组细胞侵袭数为(469.00±40.50)个, 与MCF-7野生型细胞[(445.00±35.50)个]比较, 差异均无统计学意义(均P>0.05)。在10 μmol/L奥沙利铂作用下, NAT10过表达组细胞侵袭数为(502.00±45.60)个, NAT10敲低组细胞侵袭数为(105.00±20.50)个, 与野生型细胞[(219.00±31.50)个]比较, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。在10 μmol/L奥沙利铂作用下, 与野生型细胞比较, NAT10过表达可以增强PARP1与NAT10的结合, 而使用NAT10抑制剂Remodelin则抑制了二者的相互结合。高表达NAT10诱导PARP1乙酰化后, PARP1与X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)的结合增加, 敲低NAT10的表达后, 降低了PARP1和XRCC1的结合。高表达NAT10增强了PARP1与DNA连接酶3(LIG3)的结合, 而敲低NAT10的表达则会降低PARP1与LIG3的结合。在10 μmol/L奥沙利铂处理后的细胞中, NAT10过表达细胞中γH2AX表达水平为0.38±0.02, NAT10敲低细胞中γH2AX表达水平为1.36±0.15, 与野生型细胞(1.00±0.00)比较, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。在10 μmol/L奥沙利铂处理后的细胞中, NAT10过表达组细胞凋亡率为(6.54±0.68)%, NAT10敲低组细胞凋亡率为(12.98±2.54)%, 与野生型细胞[(9.67±0.37)%]比较, 差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 NAT10高表达增强了NAT10与PARP1的结合, 并促进PARP1的乙酰化, 进而延长了PARP1的半衰期, 从而增强PARP1招募DNA损伤修复相关蛋白到损伤位点, 促进DNA损伤修复, 最终使乳腺癌细胞存活。

南方红豆杉10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶基因的克隆与生物信息学分析

对中国重要药用植物南方红豆杉中的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因进行分离、测序以及生物信息学分析。根据GenBank中已登录的10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-乙酰转移酶(DBAT)基因cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从南方红豆杉叶片中克隆了1个DBAT基因Tc-DBAT的全长cDNA。结果显示,Tc-DBAT cDNA含有1个1 323 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码440个氨基酸,对应基因组序列含有1个内含子。Tc-DBAT蛋白N端含有5个N-酰基化作用位点和2个保守的N-糖基化作用位点,具有1个保守的B ig-1结构域,多个重要的磷酸化位点以及1个类似钙结合蛋白重复结构。序列同源性比较、系统发生分析以及蛋白质高级结构预测均表明,Tc-DBAT属于转移酶超家族(transferase superfamily),是一个具有乙酰转移酶活性的功能蛋白,能够催化10-去乙酰巴卡亭Ⅲ(10-DAB)10位的乙酰化,从而生成抗癌新药紫杉醇生物合成途径中的最后一个双萜中间体——巴卡亭Ⅲ。有望通过成功克隆和鉴定紫杉醇生物合成途径中的关键酶基因达到提高其半合成前体巴卡亭Ⅲ产量的目的,并且为进一步利用组合表达系统商业化生产紫杉醇奠定基础。

多肽-N乙酰氨基半乳糖转移酶10在肺癌中的表达及意义

目的探讨检测多肽-N乙酰氨基半乳糖转移酶10(ppGalNAc-T10)单细胞技术与应用蛋白在肺癌、乳腺癌和结肠癌中的表达。方法采用免疫组织化学检测ppGalNAc-T10在110例肺癌组织、100例乳腺癌组织和110例结肠癌组织中的表达;不同的肿瘤均有10例相对应的正常组织作为对照。结果同正常肺组织相比较,ppGalNAc-T10在肺癌组织中表达较低;且ppGalNAc-T10的表达与肿瘤侵袭深度相关(P<0.01)。PpGalNAc-T10蛋白在乳腺癌和结肠癌及其相对应的正常组织的表达差异无显著性。结论PpGalNAc-T10在肺癌中,有可能成为的1个有效标记蛋白。

乳腺癌中N-α-乙酰转移酶10的表达及预后意义

目的探讨蛋白质N-α-乙酰转移酶基因10(NAA10)作为乳腺癌治疗靶点的可能性。方法通过METABRIC数据库分析33个乙酰转移酶基因与乳腺癌预后的关系,并分析NAA10基因表达与乳腺癌临床病理参数之间的关系;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)实验检测NAA10基因mRNA和蛋白水平表达,应用NAA10小干扰RNA(siRNA)处理NAA10高表达的乳腺癌细胞株,选取乳腺癌国际联盟分子分类(METABRIC)数据库1974例乳腺癌患者,其中腺腔A型(Luminal A)718例,腺腔B型(Luminal B)占488例,人表皮生长因子受体2(Her-2)过表达型占240例,基底样型(Basal-like)占329例,正常乳腺样型(Normal-like)199例。通过细胞计数试剂盒(CCK-8)和平板克隆形成实验检测NAA10基因沉默后对乳腺癌细胞增殖的影响。计数资料比较采用t检验、χ^2检验,相关性检验采用Spearman等级相关分析,。结果NAA10的mRNA表达与乳腺癌的无病生存率(DFS)及总生存率(OS)差异有统计学意义(P<0.05),其相对风险比分别为1.31(1.14~1.51),1.13(1.01~1.25);NAA10基因的表达与乳腺癌组织学分级、淋巴结状态、诺丁汉指数(NPI)明显正相关(P<0.01);NAA10的mRNA和蛋白水平在Basal-like型乳腺癌表达最高;与对照组比较,NAA10基因沉默可以抑制乳腺癌细胞增殖50%左右(P<0.05),差异有统计学意义。结论NAA10基因与乳腺癌细胞增殖密切相关且其表达水平与乳腺癌预后关系密切。

10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶迭代饱和突变与活性位点分析

目的利用迭代饱和突变技术进一步提高10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10-β-O-乙酰转移酶双突变体DBAT^(G38R/F301V)的活性;通过丙氨酸扫描确定DBAT活性中心的重要位点。方法利用迭代饱和突变技术在现有双突变体DBAT^(G38R/F301V)的基础上对Ser^(396)进行半饱和突变,筛选对10-去乙酰紫杉醇(DT)催化活性提高的突变体;对获得的高活性突变体蛋白进行催化DT的最适温度和最适pH测定;在最适pH条件下,将其分别用最适反应温度和0℃温育6 h,考察该蛋白的热稳定性;采用生物信息学方法分析活性提高的分子机制。对DBAT底物结合区域尚未进行分析的几个氨基酸进行丙氨酸扫描研究,分析这些位点在DBAT催化10-DAB和DT过程中的作用。结果获得了三突变体DBAT^(G38R/F301V/S396I),其催化DT的活性为DBAT^(G38R/F301V)的1.6倍,该蛋白催化DT的最适条件为37.5℃,pH 7.5;该蛋白在37.5℃静置6 h后催化DT的活力为初始值的30%,在0℃静置6 h后为初始值的70%;丙氨酸扫描结果显示,Asn^(45)在DBAT催化10-DAB和DT时都非常重要,而Asn^(42)、Glu^(350)、Glu^(355)和Lys^(389)位点对催化10-DAB的影响更大。结论将活性口袋内的亲水性氨基酸向疏水性氨基酸突变可能有利于DBAT对DT的催化,但氨基酸侧链的长度和空间构型也是影响催化活性的重要因素;发现Asn^(45)可能是一个潜在的DBAT催化或底物结合位点。

N-乙酰转移酶影响食管癌细胞生物学功能的研究

目的通过构建N-乙酰转移酶基因(NAA10)腺病毒表达载体,探讨其对食管癌细胞TE-1增殖、细胞周期和凋亡的影响。方法 PCR技术扩增NAA10全长编码基因,通过重组腺病毒表达系统将其克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1穿梭载体,重组腺病毒表达载体并包装腺病毒颗粒Ad-NAA10。将携带人NAA10基因的腺病毒感染食管癌细胞TE-1,Western blot检测NAA10蛋白的表达,CCK-8检测其对TE-1细胞增殖的影响,碘化丙啶(PI)染色检测其对TE-1细胞周期的影响,Hoechst/PI双染检测其对TE-1细胞凋亡的影响。结果酶切鉴定和测序证实NAA10腺病毒表达载体构建成功,腺病毒颗粒Ad-NAA10能在TE-1细胞中正常表达;NAA10可以抑制TE-1细胞的增值,影响细胞周期分布,促进细胞凋亡。结论 NAA10通过G1期阻滞和诱导凋亡从而抑制食管癌细胞的增殖,为进一步确定食管癌特异性生物标志物及探讨食管癌发病机制奠定基础。

食管鳞状细胞癌组织pp-GalNac-T10高表达与淋巴结转移有关

目的研究多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(pp-GalNac-T10)在食管鳞状细胞癌(ESCC)组织中的表达水平及其与临床指标的关系。方法对120例ESCC患者的组织芯片,采用免疫组织化学法检测pp-GalNac-T10在ESCC中的表达,并分析其表达与临床病理参数之间的关系。结果 ESCC组织中pp-GalNac-T10表达与癌旁组织类似,但pp-GalNac-T10表达的阳性率与ESCC淋巴结受累、TNM分期情况相关,pp-GalNac-T10在发生转移患者的癌组织表达强度明显高于未发生转移患者的癌组织。结论 pp-GalNac-T10的表达与ESCC的淋巴结转移有关。

ppGalNac-T10对人结直肠癌细胞株LoVo的生物学特性的影响

探讨多肽N-乙酰氨基半乳糖转移酶10(ppGalNAc-T10)对人结直肠癌细胞株LoVo细胞特性的影响.ppGalNAc-T10正义真核表达载体pcDNA3.1-T10(+)、反义真核表达载体pcDNA3.1-T10(-)与空载体pcDNA3.1分别转染LoVo细胞,Western blot检测ppGalNAc-T10蛋白水平表达的变化,确定转染效果.CCK8法检测转染后各实验组细胞增殖的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,穿膜实验检测细胞侵袭能力的变化.Western blot证明各实验组经转染不同ppGalNAc-T10载体后,ppGalNAc-T10蛋白表达量发生变化,转染pp-GalNAc-T10正义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量增加,同时细胞的增殖受到抑制,迁移能力和侵袭能力降低;而转染ppGalNAc-T10反义真核表达载体的LoVo细胞,ppGalNAc-T10的蛋白表达量降低,细胞生长加快,迁移能力和侵袭能力增强.ppGalNAc-T10可能影响人结直肠癌细胞株LoVo细胞的增殖、迁移能力和侵袭能力.