集胞藻PCC6803中N-乙酰鸟氨酸转氨酶的生化表征及结构分析

旨在对集胞藻PCC6803中slr1022基因编码的N-乙酰鸟氨酸转氨酶进行生化表征及结构分析,为进一步研究该酶的催化功能及机制奠定理论基础。以集胞藻PCC6803基因组为模板,通过PCR扩增获得slr1022基因,将其连接到表达载体pET-28a上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态。经IPTG诱导,Ni-NTA亲和层析纯化后获得重组Slr1022蛋白,然后通过紫外分光光度法对Slr1022蛋白的催化功能进行表征,并运用生物信息学软件对该蛋白进行结构分析。成功构建pET28a-slr1022重组表达质粒,并诱导表达重组Slr1022蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定该蛋白分子量约为50 kD,与理论大小相符。Slr1022蛋白与底物N-乙酰鸟氨酸的结合常数K_m和最大反应速度V_(max)分别是0.12 mmol/L和0.60 μmol/(L·s),并且Slr1022蛋白与另一底物α-酮戊二酸的K_(m)和V_(max)分别是0.039 mmol/L和0.65 μmol/(L·s)。Slr1022蛋白在pH 8.5时催化活性最强。Slr1022蛋白和其他来源的N-乙酰鸟氨酸转氨酶氨基酸序列有一定的同源性,而且活性位点的氨基酸残基高度保守。成功克隆并表达纯化出Slr1022蛋白,酶学性质和生物信息学研究表明Slr1022蛋白为N-乙酰鸟氨酸转氨酶。

钝齿棒杆菌N-乙酰鸟氨酸转氨酶的克隆表达分析及其重组菌的精氨酸发酵

N-乙酰鸟氨酸转氨酶(EC 2.6.1.11,ACOAT)是钝齿棒杆菌Corynebacterium crenatum精氨酸合成途径中的第4个酶,催化底物N-乙酰谷氨酸半醛生成产物N-乙酰鸟氨酸。为研究N-乙酰鸟氨酸转氨酶在钝齿棒杆菌中精氨酸合成中的作用,考察其酶学性质,对培养基成分和发酵过程工艺条件的优化提高精氨酸产量提供依据。从精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌SYPA 5-5染色体扩增获得ACOAT编码基因argD,全长1 176 bp,编码390个氨基酸,在Escherichia coli BL21(DE3)及C.crenatum SYPA中成功表达。采用Ni柱亲和层析纯化后获得的重组蛋白比酶活达108.2 U/g,对其部分酶学性质进行初步研究。构建重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA(pJCtac-CcargD),加强精氨酸合成途径ACOAT蛋白表达量,对重组菌产精氨酸进行初步发酵分析。多次发酵结果表明重组钝齿棒杆菌与出发菌株相比胞内ACOAT酶活得以增强;重组菌CCD1精氨酸平均产量为39.7 g/L,产酸提高14.7%。结果还表明在重组菌发酵精氨酸的同时不仅ACOAT得到了加强表达,同时还提高了重组菌在发酵过程中菌体自身的氧利用率。