用CODEHOP设计简并引物克隆B49乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACK-J1以高效产氢菌B49基因组DNA进行PCR,得到655bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,发现此DNA产物与其他乙酸激酶基因有高度的相似性.所克隆的序列为B49的乙酸激酶基因片段.用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高.该基因的成功克隆将为高效产氢菌B49代谢工程研究和降低其反应器酸化研究提供科学依据.

乙酸激酶编码基因缺失的L–色氨酸生产菌株的理性构建

针对L–色氨酸生产菌株(Escherichia coli TRTH)发酵生产L–色氨酸过程中乙酸积累的问题,本文采用基因组学的方法证实了该菌株基因组上存在乙酸激酶编码基因ack A及tdc D的完整基因序列;并通过敲除ackA、tdcD构建出菌株TRTHA(TRTH,Δack A)、TRTHT(TRTH,Δtdc D)、TRTHAT(TRTH,Δack AΔtdc D),进而考察ack A或/和tdc D缺失对L–色氨酸发酵的影响.结果表明:基因ack A或/和tdc D的缺失会使得乙酸积累减少、菌体生物量及其L–色氨酸产量增加,但同时会造成谷氨酸积累量的增加;菌株TRTHA的生物量及L–色氨酸产量均高于TRTHT.利用TRTHAT菌株发酵生产L–色氨酸时,菌体生物量、L–色氨酸产量和糖酸转化率分别为47.48,g/L、40.52,g/L和15.44%,,较TRTH菌株分别提高了6.03%,、7.94%,及7.82%,;乙酸和谷氨酸积累量分别为1.41,g/L、8.58,g/L,较TRTH菌株分别降低了10.19%,、提高了12.15%,.由TRTH与TRTHAT菌株的代谢流分析得知,与出发菌株TRTH相比,TRTHAT菌株的乙酸合成代谢流降低了72.78%,谷氨酸合成代谢流提高了13.13%,,L–色氨酸合成代谢流是TRTH菌株的1.74倍.

Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因(ack)的克隆与序列分析

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,它的大量生成能够造成环境p H值的改变并且抑制菌体的生长,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶是乙酸生成的关键酶,敲除其相关基因,理论上可以减少乃至消除乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本研究根据Klebisella oxytoca KCTC1686和Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶基因ack序列的相似性设计引物,以产酸克雷伯氏菌基因组DNA和质粒载体p T-ack为模板,利用PCR克隆得到了乙酸激酶部分基因ack,长度为856bp,无碱基缺失。ORF分析发现该部分基因没有完整的开放阅读框,但是全部位于Klebisella oxytoca KCTC1686 ack基因的开放阅读框内。结果表明该片段为Klebisella oxytoca HD79乙酸激酶部分基因序列,为后续构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶突变株奠定了基础。

L-氨基酸连接酶偶联乙酸激酶催化合成丙谷二肽

枯草芽孢杆菌来源的L-氨基酸连接酶(YwfE)是一种ATP依赖酶,可以催化L-丙氨酸(Ala)和L-谷氨酰胺(Gln)合成丙谷二肽。为了降低反应中ATP的使用量,研究使用不同微生物来源的乙酸激酶(Ack)用于丙谷二肽合成反应中ATP的再生,发现丙酮丁醇梭菌来源的乙酸激酶Ack3和YwfE的偶联效果最好。确定最优的催化反应体系包括Ala 30 mmol/L,Gln 30 mmol/L,MgSO 450 mmol/L,ATP 5 mmol/L,ACP-Li 60 mmol/L,纯化的YwfE蛋白200 mg/L,纯化的Ack3蛋白80 mg/L。在37℃,pH 9条件下反应16 h生成24.3 mmol/L的丙谷二肽,摩尔转化率为81%,同时产生2.3 mmol/L的副产物丙丙二肽。研究表明:ATP再生系统的引入有助于提高丙谷二肽的摩尔转化率,降低催化反应的成本。

λRed技术构建产酸克雷伯氏菌乙酸激酶基因缺失突变株

乙酸是2,3-丁二醇典型代谢途径中的主要副产物之一,并对2,3-丁二醇的代谢产生影响。乙酸激酶(acetate kinase,ack)是乙酸生成途径中的关键酶,敲除ack基因,理论上可以阻断乙酸的产生,从而提高2,3-丁二醇的产量和得率。本文利用λRed技术构建乙酸激酶基因敲除重组质粒p T-LKR,通过酶切、纯化获得线性片段ack L-Kanr-ackR,将其电转化至Klebisella oxytoca HD79中,卡那霉素抗性筛选阳性转化子。结果表明,经PCR及测序验证K.oxytoca HD79乙酸激酶缺失工程菌株构建成功,为后续进一步提高2,3-丁二醇的产量和扩大菌株选择范围奠定基础。

用CODEHOP设计简并引物克隆反刍月形单胞菌K6乙酸激酶基因片段

利用CODEHOP设计细菌乙酸激酶的简并引物,选用1对引物ACKSe以高效丙酸生成菌反刍月形单胞菌K6基因组DNA进行PCR,得到749 bp PCR产物,产物经pMD18-T载体克隆转化至DH5α大肠杆菌中,测序后经Blastx比对,此DNA产物与其他菌属来源的乙酸激酶蛋白序列具有相似性,所克隆的序列即为K6的乙酸激酶基因片段。用CODEHOP程序化设计的简并引物可信性强,阳性率高。该基因的成功克隆为丙酸生成菌K6乙酸代谢工程研究提供了依据。

基于pGhost4系统保加利亚乳杆菌乙酸激酶敲除载体的构建

保加利亚乳杆菌凭借其微生物特性和效能优异等特点成为当下产乳酸最重要的微生物菌株之一。乙酸是保加利亚乳杆菌代谢乳酸最主要的副产物,它的大量生成降低葡萄糖的代谢利用率,并且消耗了能量。乙酸激酶是控制乙酸生成的关键酶,敲除乙酸激酶基因,理论上可以阻断戊糖磷酸途径中乙酸的生成,从而优化代谢途径提高葡萄糖代谢乳酸的利用率。研究以Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus ATCC 11842公布的乙酸激酶基因ack序列设计引物,以保加利亚乳杆菌基因组DNA为模板,PCR克隆出ack上下游片段,利用重叠PCR技术将上下游片段拼接在一起,并连入具有温敏性的p Ghost4载体。

利用转座子标签法构建埃氏巨型球菌乙酸生成关键酶基因缺失工程菌

应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌埃氏巨型球菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸钠的选择性培养基筛选接合子,共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌9株。对埃氏巨型球菌的突变株进行16SrRNA和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶(AK)和磷酸转乙酰酶(PTA)酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。

反刍月形单胞菌乙酸生成缺陷株的构建及相关酶活性分析

[目的]构建反刍月形单胞菌乙酸生成的缺陷株并分析其发酵特性。[方法]应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌反刍月形单胞菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子。[结果]共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌7株。对反刍月形单胞菌的突变株进行16S rRNA鉴定和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶(AK)和磷酸乙酰转移酶(PTA)酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。[结论]该研究为进一步研究反刍兽瘤胃微生物乙酸的细胞代谢网络和调控奠定基础。

反刍月形单胞菌乙酸生成缺陷株的构建及相关酶活性分析(英文)

[目的]构建反刍月形单胞菌乙酸生成的缺陷株并分析其发酵特性。[方法]应用转座子标签法,通过转座子供体菌E.coliS17-1/pZJ25∷Tn5对受体菌反刍月形单胞菌进行转座子诱变,采用含卡那霉素和氟乙酸纳的选择性培养基筛选接合子。[结果]共筛选出稳定的对卡那霉素和氟乙酸具有抗性的转座工程菌7株。对反刍月形单胞菌的突变株进行16SrRNA鉴定和Tn5的PCR鉴定,及乙酸激酶(AK)和磷酸乙酰转移酶(PTA)酶比活力分析,确定突变株属于pta基因缺失型氟乙酸抗性菌株。[结论]为进一步研究反刍兽瘤胃微生物乙酸的细胞代谢网络和调控奠定基础。

谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢PTA、AK、ICL和MS酶活性研究

从谷氨酸棒状杆菌乙酸盐代谢中涉及的磷酸转乙酰酶PTA、乙酸盐激酶AK、异柠檬酸裂解酶ICL和苹果酸合成酶MS 4种酶入手,建立了一套稳定的酶活性测定方法,并对这些酶在葡萄糖和乙酸盐不同碳源代谢中的酶活性特征进行了比较分析,发现碳代谢中存在葡萄糖效应;乙酸盐对谷氨酸棒状杆菌PTA、AK、ICL和MS酶活性有明显的诱导作用.

肠膜明串珠菌基因失活体系的建立

构建肠膜明串珠菌的基因失活体系。四环素抗性基因表达盒连接到pTA2 T载体上,在T载体的左右多克隆位点上分别定向插入ack(乙酸激酶)的上、下游同源臂,构建成自杀性同源重组载体,转化明串珠菌,使染色体的ack失活,得到突变型。检测突变型产乙酸的量并利用PCR验证ack失活。与原始菌株相比,突变型的乙酸产量减少49.1%;突变型的ack PCR扩增产物比原始菌株的大1200 bp左右。成功地使ack基因失活,说明肠膜明串珠菌基因失活体系的构建成功。

ATP合成菌株的构建及用于联合生产S-腺苷甲硫氨酸

为降低S-腺苷甲硫氨酸的生产成本,构建了同时表达腺苷激酶、腺苷酸激酶和乙酸激酶3 种酶的重组大肠杆菌菌株用于ATP 的合成,并对ATP 的转化条件进行了优化,优化后的反应体系为:腺苷30 mmol/L,乙酰磷酸二锂盐135 mmol/L,硫酸镁5 mmol/L,硼砂50 mmol/L,菌体2 g/L(湿重),反应液初始pH7.5,反应温度为35℃,反应时间为3 h,反应转化率可以达到99%以上。按照上述反应体系进行5 L 放大,反应结束后再投入65 mmol/L D,L-甲硫氨酸和50 g/L(湿重)表达腺苷甲硫氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌体,并补加15 mmol/L 硫酸镁,转化18 h S-腺苷甲硫酸浓度能达到8.7 g/L,转化率达到72.5%。

amrG1基因在谷氨酸棒杆菌乙酸活化中的作用

谷氨酸棒杆菌Corynebacteriumglutamicum可以利用乙酸为碳源和能源进行生长.乙酸代谢中涉及乙酸活化的两个酶为磷酸转乙酰酶PTA和乙酸激酶AK,它们是由pta-ack操纵子经诱导表达产生的.采用转座子挽救法,我们从调控突变株C.glutamicumG25中获得了amrG1和amrG2两个目标基因.经分析鉴定,amrG1基因(NCBIGenBank接受号为AF532964)可能参与乙酸代谢调控,编码作用于pta-ack操纵子的一个调控因子.该调控因子基因序列全长732bp,开放阅读框含有243个氨基酸,分子量约为27kD.通过基因定点缺失和过量表达技术,在谷氨酸棒杆菌野生型菌株中分别构建了amrG1基因缺失菌株和表达菌株,并研究了它们在含有葡萄糖和/或乙酸不同碳源的基本培养基上生长时产生的PTA和AK酶活性特征.酶活性测定结果发现其中的amrG1基因缺失菌株和表达菌株存在着与野生型菌株不同的一系列酶学特征,分析显示:以野生型菌株为对照,amrG1基因缺失菌株在含有葡萄糖碳源的培养基上生长时表现出较高的PTA和AK酶活性,并且在葡萄糖和乙酸两种碳源上生长时表现出与乙酸碳源上生长时几乎同样的PTA和AK酶活性;amrG1基因过量表达对葡萄糖碳源上生长产生的PTA和AK酶活性有一定程度的抑制,即表现出与基因缺失情况相反的调控效应.根据以上结果分析。