血清高迁移率族蛋白B1、β_(2)-微球蛋白、乳酸脱氢酶及白细胞介素-6在多发性骨髓瘤中的表达及相关性

目的 探讨血清高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、β_(2)-微球蛋白(β_(2)-MG)、乳酸脱氢酶(LDH)及白细胞介素-6(IL-6)在多发性骨髓瘤中的表达及相关性。方法 选取60例健康体检者和86例多发性骨髓瘤患者,其中31例初诊未治,55例接受硼替佐米+地塞米松+沙利度胺(BDT)方案化疗。比较多发性骨髓瘤患者与体检者、初诊未治与BDT方案治疗不同临床疗效患者、不同临床分期初诊未治多发性骨髓瘤患者血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6水平。血清HMGB1水平与β_(2)-MG、LDH、IL-6水平的相关性采用Pearson相关分析。结果 多发性骨髓瘤患者血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH及IL-6水平均明显高于体检者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。初诊未治及无效患者血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均明显高于有效患者,无效患者血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均明显高于初诊未治患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。临床分期为Ⅱ、Ⅲ期的初诊未治多发性骨髓瘤患者血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均明显高于Ⅰ期患者,Ⅲ期患者的血清HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均明显高于Ⅱ期患者,差异均有统计学意义(P﹤0.01)。Pearson相关分析显示,血清HMGB1水平与β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均呈正相关(r=0.902、0.867、0.882,P﹤0.05)。结论 多发性骨髓瘤患者血清HMGB1水平较高,BDT方案治疗后可使其显著降低,且与β_(2)-MG、LDH、IL-6水平均呈正相关,临床可联合HMGB1、β_(2)-MG、LDH、IL-6共同作为评估多发性骨髓瘤疾病严重程度和治疗效果的分子靶点。

乙醇脱氢酶1B-rs1229984和乙醛脱氢酶2基因-rs671多态性实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立乙醇脱氢酶1B(ADH1B)基因rs1229984(G/A)和乙醛脱氢酶2基因rs671(G/A)多态性的实时荧光定量PCR分型方法。方法分别采用双Taq Man-MGB探针法建立ADH1B-rs1229984多态性,和ARMS-Taq Man探针法建立ALDH2-rs671多态性的实时荧光定量PCR分型方法。根据荧光定量PCR的循环阈值(Ct值)的差值ΔCt值判定等位基因型,并采用所建方法对345例中国汉族人进行了分型检测。结果所建方法对345例研究对象分型检测显示,ADH1B-rs1229984多态性的GG(ADH1B*1/*1)、GA(ADH1B*1/*2)和AA(ADH1B*2/*2)型的ΔCt值(ΔCt=G型Taq Man-MGB探针Ct值-A型Taq Man-MGB探针Ct值)分别为-13.72±1.33(40例)、0.50±0.17(150例)和6.62±0.54(155例);ALDH2-rs671的GG(ALDH2*1/*1)、GA(ALDH2*1/*2)和AA(ALDH2*2/*2)型的ΔCt值(ΔCt=G引物反应体系Ct值-A引物反应体系Ct值)分别为-15.30±0.84(239例)、0.17±0.45(96例)和15.86±0.74(10例)。345例研究对象中,ADH1B*1/*2和ALDH2*1/*1(31.3%)、ADH1B*2/*2和ALDH2*1/*1(28.7%)是2个等位基因的主要组合型(60%),未见ADH1B*1/*1和ALDH2*2/*2组合型。结论所建分型检测方法皆具有闭管、一步检测、准确和高通量等特点。

PCR-CTPP简单快速检测乙醇脱氢酶-1B基因多态性

目的建立两对交叉引物-聚合酶链反应(PCR-CTPP)检测体系鉴别乙醇脱氢酶-1B基因多态性。方法针对ADH1B rs1229984位点设计两对内外引物,经过聚合酶链反应、电泳鉴别基因型,将该方法与DNA测序法比较,验证其检测准确性,并通过该方法检测58例健康人ADH1B基因多态性分布情况。结果 PCR-CTPP方法可用于准确检测ADH1B基因多态性,与DNA测序结果相符;在58例健康人中,ADH1B A等位基因频率71.6%,为优势等位基因。结论PCR-CTPP技术检测ADH1B基因多态性简单快速、经济省力,可用于疾病易感基因的快速筛查和分子流行病学研究,适合在一般实验室推广应用。

1-磷酸甘露醇脱氢酶基因转化水稻的研究

PCR和 Southern blotting检测表明 ,来自大肠杆菌的 mtl D基因已通过农杆菌介导整合进水稻基因组。mtl D基因在 T1代出现分离 ,T2 代出现纯系。在 0 .75% Na Cl胁迫下 ,7个转基因 T3 代株系都能检测到 mtl D酶活性 ,与对照相比细胞膜的相对电导率和大分子渗漏值明显降低。部分转基因株系能在 1 .0 % Na Cl浓度下正常生长 ,而对照在 0 .5% Na Cl浓度下已不能存活。通过有性杂交途径实现了 mtl D和 gut D两个基因的聚合 ,部分杂交后代株系能在 1 .2 5% Na Cl胁迫下正常生长结实。

11β-羟基类固醇脱氢酶1型抑制剂对高脂血症大鼠肝脏、脂肪和骨骼肌脂代谢基因的影响

目的探讨11β-羟基类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)抑制剂BVT 2733对高脂血症大鼠肝脏、脂肪和骨骼肌脂代谢基因表达的影响。方法采用高脂饮食喂养建立高脂血症大鼠模型。将40只高脂血症大鼠随机分为模型组和BVT 2733(20 mg/kg)组,每组20只。另取20只普通饲料喂养的SD大鼠作对照组。分别观察BVT 2733对甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平的影响,并测定肝脏和肾周、大网膜及睾周脂肪组织脂肪含量,测定腓肠肌组织中Rev-erba、FAT/CD36、SCD1及CPT1 mRNA的表达水平。结果 BVT 2733治疗后,高脂血症大鼠的TG、TC和LDL-C明显低于模型组(P<0.05),并且肝脏和内脏脂肪的脂肪含量明显低于模型组(P<0.05),腓肠肌组织中Reverba mRNA水平明显低于模型组(P<0.05),FAT/CD36、SCD1及CPT1 mRNA水平明显高于模型组(P<0.05)。结论 BVT 2733可改善高脂血症大鼠的血脂及脂蛋白水平紊乱,降低肝脏脂肪含量并稳定骨骼肌脂代谢基因表达,提示抑制11β-HSD1活性对高脂血症相关的肝脏、脂肪组织和骨骼肌异常脂质代谢有一定改善作用。

1,2,4-三氯苯双加氧酶和脱氢酶基因克隆与序列分析

通过Pseudomonas nitroreducensJ5-1对不同氯苯类底物的降解实验,发现其降解能力大小顺序为：1,2,4-三氯苯〉1,3-二氯苯〉1,2-二氯苯〉氯苯,与已报道的1,2,4-三氯苯降解菌株在底物利用的特性方面存在差异.采用PCR技术从J5-1中扩增获得氯苯降解过程中的关键酶——氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列,分别命名为tcbA和tcbB,序列比对发现其与Burkholderia sp.PS12的氯苯双加氧酶和脱氢酶的基因序列同源性最高.通过J5-1的氯苯双加氧酶α亚基（TcbAa）与PS12的氯苯双加氧酶α亚基（TecA1）的氨基酸序列比对发现,在307-310位置有连续4个氨基酸残基的差异（I307L、M308TI、309V、Q310E）,这可能是造成2株菌对1,2,4,5-四氯苯降解偏好性差异的原因.此外,通过催化芳香化合物降解的双加氧酶α亚基的系统进化分析,认为TcbAa属于甲苯/联苯亚科,且与多取代氯苯双加氧酶α亚基的同源性最大.

假单胞菌(Pseudomonas sp. cn 4902)甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及表达

参照几种生物的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因 (mtlD)的序列设计引物 ,以极端耐盐的假单胞菌 (Pseudomonassp cn 4 90 2 )的总DNA为模板 ,采用PCR扩增、构建重组高效表达载体以及生物信息学研究等方法 ,进行基因克隆、表达及功能定性等研究。结果表明 ,克隆获得一长为 114 9bp的基因。经蛋白质保守区域研究 ,初步判别该基因为mtlD结构基因。将该基因与pBV2 2 0质粒构建成高效表达原核重组载体pBH。SDS PAGE电泳表明 ,含pBH的转化子产生特异的、分子量约为 4 1kD的蛋白带 ,表达量约占菌体可溶性蛋白 6 7%。转化子的耐盐水平比对照提高了约 1/5。在含 0 9mol/LNaCl的液体培养基中 ,转化子培养 2 4h后其生物量约是对照的 10 2倍 ,甘露醇含量约是对照的 4 1倍。可见 ,假单胞菌的甘露醇 1 磷酸脱氢酶基因是一个重要的耐盐相关基因 ,该基因已在GenBank登记 ,代号为AY112 6 96。

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物,以马来丝虫mRNA为模板,RT-PCR扩增BmG3PD基因,将其克隆入pGEM-T载体,转化大肠埃希菌(E.coli)DH5α,筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定,获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD,经序列分析及同源性比较,以及对其编码产物进行B细胞表位预测,结果表明PCR扩增的特异性条带为1020bp,与预期相符,与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测,氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。

重组短链脱氢酶LcSDR催化(R)-1-苯基乙醇不对称合成的工艺开发

采用基因挖掘技术从Lactobacillus composti基因组中筛选到一条编码短链脱氢酶(LcSDR)的序列,该LcSDR能不对称还原苯乙酮(1a)合成(R)-1-苯基乙醇[(R)-1b]。构建了Lc SDR和葡萄糖脱氢酶(EsGDH)双酶偶联催化合成体系,优化了Lc SDR不对称还原1a合成(R)-1b的催化工艺参数。在较佳催化条件下,50 g/L1a转化反应2 h,产物(R)-1b得率93.8%,产物对映体过量值(eep)高于99%,该手性生物合成催化过程的时空产率达到562.8 g/(L·d)。

共转染小干扰RNA质粒联合抑制HeLa细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和转酮醇酶样基因-1表达

目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)及转酮醇酶样基因-1(transketolase like-1,TKTL-1)是肿瘤细胞磷酸戊糖代谢途径(pentose phosphate pathway,PPP)的2个重要关键调节酶。拟通过共转染小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)表达载体同时沉默人宫颈癌Hela G6PD及TKTL-1后,观察其对G6PD和TKTL1的联合抑制作用,旨在探讨共转染siRNA表达载体联合抑制PPP的效果及可行性。方法分别构建靶向G6PD和TKTL1基因siRNA干扰质粒载体,通过酶切和测序鉴定siRNA干扰质粒载体构建成功后,单独或共转染HeLa细胞株,RT-PCR检测G6PD、TKTL1 mRNA表达并结合G6PD、转酮醇酶(transketolase,TKT)活性测定判断并比较共转染联合抑制Hela细胞G6PD、TKTL1表达的效果。结果共转染靶向G6PD和TKTL1基因的siRNA干扰载体能显著下调G6PD和TKTL1基因表达水平[(0.96±0.05)vs(0.47±0.04),(0.98±0.05)vs(0.41±0.04),P<0.01]。同时,2个酶的活性也显著下降(99.2%vs34.5%和99.8%vs 40.1%,P<0.01)。共转染抑制G6PD基因mRNA表达较单独转染靶向G6PD基因的siRNA干扰载体的效果有显著下降[(0.47±0.04)vs(0.31±0.04),P<0.01)]。结论共转染siRNA干扰载体对人宫颈癌HeLa细胞PPP代谢通路进行联合抑制是一种有效的实验方案。

11β-羟化类固醇脱氢酶1型基因微卫星多态性与肥胖的相关性研究

目的:探讨中国南京汉族人群中11β-羟化类固醇脱氢酶1型基因多态性与肥胖是否存在相关性。方法:选择11β-羟化类固醇脱氢酶1型基因附近高杂合度微卫星DNA多态标记,应用聚合酶链反应及变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,探查这一微卫星多态在中国南京汉族人群156例(对照组)与128例肥胖症患者(肥胖组)中的基因频率分布差异。结果:该多态位点存在8种等位基因,CA重复序列分别重复13、14、15、16、17、18、19和20次,病例-对照群体分析结果表明,两组间等位基因频率总体分布差异无统计学意义(χ2=7.583,P=0.361)。但CA18等位基因肥胖组频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=5.371,P=0.020),可初步认为CA18等位基因与肥胖发生有关。结论:南京地区汉族人群中11β-羟化类固醇脱氢酶1型基因多态性可能与肥胖有一定关系。

异柠檬酸脱氢酶-1基因突变与脑胶质瘤关系的研究进展

胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发肿瘤,具有较高的异质性,其发病率约占中枢神经系统肿瘤的27%左右[1]。在脑胶质瘤中,恶性脑胶质瘤在临床上更为常见,有研究数据表明,约占恶性肿瘤的80%[2]。目前,临床上主要通过WHO分级对脑胶质瘤患者的病情严重程度及预后情况进行评估,分级越高表明患者病情越严重,预后越差,故早期诊断并及时对病情变化进行准确判断是改善患者预后的重要手段,故明确脑胶质瘤的发病机理为首要关注内容[3]。

人乙醇脱氢酶ADH1C*1等位基因的克隆与鉴定

目的:克隆人乙醇脱氢酶ADH1C*1等位基因。方法:取人癌旁正常肝组织,用RT-PCR法获得ADH1C基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经过蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST对比分析进行鉴定。结果:①用RT-PCR方法扩增出与预期大小相符的ADH1C基因片段;②经蓝白筛选获得了带pUC19-ADH1C重组质粒的白色菌落;③用限制性酶谱和DNA测序并作BLAST分析证实pUC19-ADH1C*1重组质粒构建成功。结论:本实验构建的pUC19-ADH1C*1重组质粒,含有ADH1C*1结构基因的所有序列,与GeneBank数据库中的ADH1C基因的RefSeq序列比对,其碱基序列的一致性达到99%,氨基酸序列的一致性达到100%。在构建pUC19-ADH1C*1重组质粒时,采用双酶切的方法,可以很方便的定向克隆到真核表达载体中进行进一步的研究。

啤酒酵母HD34-1乙醇脱氢酶活性的研究

菌株HD34-1是将B.sub的乙醇脱氢酶(ADH)基因转入啤酒酵母HD34而构建的无醇啤酒酵母工程菌株,该菌株的ADH基因受Gal启动子的控制,因此为了考察该菌株ADH基因的表达情况,本研究设计了半乳糖和乙醇的浓度梯度进行发酵试验并测定了相应条件下的的ADH活性,结果表明2%的半乳糖浓度,诱导16h最适宜ADH基因的表达。

人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因的克隆与序列分析

目的克隆人醇脱氢酶ADH1B*2等位基因,并对克隆序列进行序列分析。方法用RT-PCR法获得ADH1B基因的cDNA,然后用双酶切得到目的基因并定向克隆到pUC19载体上。经蓝白筛选后,用限制性酶谱和DNA测序以及BLAST比对分析鉴定,并用SNPBLAST比对分析和查询dbSNP数据库,分析所克隆序列的单核苷酸多态性。结果证实所克隆序列为ADH1B*2等位基因。提示ADH1B*2等位基因有2个位点存在单核苷酸多态性。结论成功克隆了ADH1B*2等位基因,并进行了SNP分析。

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。

大肠杆菌Top10甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase,mtlD)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了mtlD基因(Acession numeber:EU433565)。mtlD开放阅读框为1149bp,编码含有382个氨基酸残基,分子量为41.2kD的蛋白,预测等电点为5.37。mtlD含有38个碱性氨基酸,50个酸性氨基酸,158个疏水氨基酸及72个极性氨基酸。二级结构预测表明该蛋白含约60.47%的α-螺旋、4.71%的β-转角、10.73%的延伸链和20.48%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,mtlD是亲水性蛋白。亚细胞定位分析表明mtlD主要定位于细胞质中。序列分析表明大肠杆菌Top10mtlD基因与大肠杆菌W3350、大肠杆菌DEC12a和盐生盐杆菌(Halobacterium salinarum)的mtlD基因同源性分别为99%、97%和93%。大肠杆菌Top10mtlD基因的克隆及生物信息学分析为今后对mtlD的进一步深入研究奠定了基础。

薏苡乙醇脱氢酶基因(ADH1)3’末端序列的克隆

采用3’-RACE技术,根据前一阶段已克隆的的薏苡(Coix lacrymajobi L.)乙醇脱氢酶基因(ADH1)cDNA片段(Accession DQ455071)设计特异性引物,克隆出556bp的乙醇脱氢酶3’末端cDNA序列,利用DNAMEN软件将获得序列与已知序列进行拼接,得到了1个1234bp的cDNA序列。

乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是抗癌药物克唑替尼的手性合成前体,可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶催化还原制备,还原中所需的还原型辅酶Ⅱ再生是该反应的技术瓶颈。本研究构建重组大肠杆菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH,实现了葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的共表达,并进行偶联转化。结果表明,当在反应温度为30℃,p H为7的条件下,(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产量达到最高,在投料量为6%时,该体系转化率为93.75%。